PCR là một kỹ thuật được phát triển vào những năm 1970, mục tiêu chủ yếu là nhân bản DNA mục tiêu thành nhiều các bản sao. Trong vài thập kỷ qua, PCR truyền thống đã được cải tiến thành các loại kỹ thuật đa dạng, hiện nay có hơn 30 biến thể của kỹ thuật PCR (Rajalakshmi, 2017). Trong đó, nested PCR là một trong kỹ thuật biến thể có khả năng gia tăng tính đặc hiệu của phản ứng.
Vậy Nested PCR là kỹ thuật như thế nào?
Nested PCR làm giảm sự khuếch đại sản phẩm không đặc hiệu bằng việc thực hiện hai phản ứng PCR liên tiếp. Phản ứng đầu tiên (PCR vòng ngoài) được thực hiện với cặp mồi bao phủ đoạn trình tự bổ sung ở hai đầu của gen mục tiêu. Như vậy, sản phẩm của phản ứng đầu tiên này là vùng có chứa DNA mục tiêu. Sau đó sản phẩm của phản ứng đầu tiên được dùng làm trình tự khuôn cho phản ứng PCR thứ hai (PCR vòng trong) , phản ứng này được thực hiện với cặp mồi gắn đặc hiệu với đoạn chỉ chứa trình tự mục tiêu và tăng độ đặc hiệu cảu phản ứng.
Các loại nested PCR
Kỹ thuật này chia làm hai loại cơ bản: double-tube và single-tube nested PCR. Double-tube nested PCR là kỹ thuật thực hiện hai phản ứng PCR ở hai tube khác nhau, sản phẩm ở tube PCR lần thứ nhất sẽ được dùng làm mẫu đầu vào cho phản ứng PCR tiếp theo ở tube thứ hai. Loại này giúp làm gia tăng độ đặc hiệu cũng như độ nhạy phản ứng, đặc biệt là đối với cặp mồi có độ nhạy thấp. Tuy nhiên, nguy cơ ngoại nhiễm lại rất cao khi sử dụng loại double-tube, do phải mở nắp ở cả hai tube khi thêm sản phẩm PCR vòng ngoài vào tube PCR vòng trong.
Đối với loại single-tube, cả hai phản ứng PCR được kết hợp vào cùng một tube (hay còn gọi là non-stop nested PCR), nghĩa là sau khi phản ứng PCR vòng ngoài diễn ra thì không cần dừng lại lấy sản phẩm mà tiếp tục thực hiện PCR vòng trong ngay sau đó mà không cần đổi tube. Loại single-tube giúp hạn chế nguy cơ nhiễm chéo cũng như giảm thời gian thực hiện phản ứng hơn so với double-tube.
Để thực hiện được single-tube thì mồi cho phản ứng PCR vòng ngoài (outer primers) được thiết kế sao cho có nhiệt độ bắt cặp cao hơn mồi của phản ứng PCR vòng trong (inner primers) từ 8-10oC, điều này giúp giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của các cặp mồi ở mỗi phản ứng PCR. Nồng độ cặp mồi vòng ngoài cần được tối ưu tránh dư thừa. Ngoài ra, nested PCR còn một biến thể khác là semi-nested PCR, loại này sử dụng một mồi vòng ngoài làm một trong hai mồi của cặp mồi vòng trong hay nói cách khác là kỹ thuật này chỉ sử dụng ba mồi cho cả hai phản ứng.
Ứng dụng của nested PCR
Như vậy, nested PCR là kỹ thuật làm tăng độ đặc hiệu và độ nhạy khi nhân bản sản phẩm DNA mục tiêu bằng cách thực hiện hai phản ứng tổng hợp. Thêm vào đó để gia tăng hiệu quả nhân bản thì nested PCR cũng được kết hợp với nhiều kỹ thuật PCR khác như real-time PCR hay multiplex PCR. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong phân tích phát sinh gene (phylogenetic analysis) hay đa hình di truyền (genetic polymorphism) ứng dụng trong việc phát hiện các gene gây bệnh hay đột biến.
Một ứng dụng hiệu quả của nested PCR đó là xác định bệnh đốm trắng trên tôm trong thời gian ngắn. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới thì việc nuôi trồng tôm đang có xu hướng phát triển nhanh. Tuy nhiên đi đôi với sự phát triển đó là sự bùng phát của các dịch bệnh gây hại cho tôm ảnh hưởng đến chất lượng cũng như tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng.
Đặc biệt tôm rất hay bị tấn công bởi các loại virus như virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), virus IHHNV (Infectious Hypothermal and Hematopoietic Necrosis Virus, IHHNV), virus gây hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV), bệnh hoại tử tuyến ruột giữa (Baculovirus Migut and Necrosis – BMN), … Trong đó, loài WSSV được coi là “sát thủ” nguy hiểm ở các ao nuôi tôm, do nó có thể gây tỷ lệ chết khi bị nhiễm lên đến 80 – 100% sau khoảng 10 ngày nhiễm.
Do vậy nested PCR giúp chẩn đoán nhanh chóng mầm bệnh ở ao nuôi tôm, từ đó giảm thiệt hại cho người nuôi. Các nghiên cứu ở Đại học Cần Thơ thực đã sử dụng nested PCR để phát hiện WSSV trên tôm và có những đánh giá về quy trình (T.T. Tuyết Hoa, 2011). Quy trình này đã cho thấy hiệu quả trong việc phát hiện WSSV từ nhiều đối tượng cảm nhiễm, với độ nhạy cao và thời gian khuếch đại khoảng hai giờ. Một nghiên cứu tương tự cũng được thực với mẫu tôm từ Cà Mau, nested PCR được sử dụng và mang lại độ chính xác và độ nhạy cao trong thời gian ngắn.
Ngoài bệnh trên tôm, nested PCR cũng được nghiên cứu ứng dụng trong việc chuẩn đoán phát hiện và xác định type porcine circovirus type 2 (PCV2) gây ra nhiều hội chứng bệnh ở lợn như hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS), hội chứng viêm da và viêm thận (Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome – PDNS), hội chứng viêm đường hô hấp (Porcine Respiratory Diseases Complex) và hội chứng rối loạn sinh sản (Porcine Reproductive Disorders) (Opriessnig, 2007). Nghiên cứu cho thấy phản ứng nested PCR giúp xác định sự có mặt của PCV2 tương ứng với triệu chứng lâm sàng của lợn (có/không có triệu chứng bệnh) (HT Mỹ Lệ, 2012).
Đối với chẩn đoán bệnh trên người, Roy và cộng sự (2021) đã thực hiện đánh giá hiệu quả chẩn đoán bệnh sốt phát ban bằng nested PCR và kỹ thuật LAMP. Kết quả đã phát hiện DNA của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi bằng cách nhắm mục tiêu gen 47-kDa. Kết quả nghiên cứu ghi nhận được với kỹ thuật nested PCR cho độ nhạy 29,73% trong khi LAMP là 16,22%. Độ đặc hiệu của nested PCR và LAMP rất cao, lần lượt là 99,58% và 99,16%. Độ chính xác chẩn đoán của PCR lồng nhau (90,15%) được cho là tốt hơn đôi chút so với LAMP (87,96%).
Kỹ thuật nested PCR kết hợp multiplex PCR cũng được sử dụng để gia tăng hiệu quả trong xác định kiểu gene của HPV (Mudhiget, 2022). Các plasmid chứa HPV-DNA và mẫu mô ung thư cổ tử cung được dùng để đánh giá nested-multiplex PCR (NM-PCR). Trong PCR vòng đầu, các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại 38 loại HPV. Ở PCR vòng hai, các đoạn mồi đặc hiệu được sử dụng cho 15 loại HPV. Kết quả ghi nhận được cho thấy NM-PCR có thể khuếch đại tất cả các loại HPV từ 75 mẫu, kỹ thuật này hướng đến việc trở thành phương pháp hứa hẹn để xác định chính xác kiểu gen của HPV.
Một công bố khác cũng ghi nhận hiệu quả của việc sử dụng kỹ thuật semi-nested PCR để phát hiện các chủng Helicobactor pylori mang gene CagA trực tiếp từ mẫu dịch dạ dày (Nguyễn Phú Hùng, 2020) . Nghiên cứu hướng đến tầm soát ung thư dạ dày cũng như giảm tính xâm lấn so với các phương pháp phân tích từ mô dạ dày. Phân tích trên 35 mẫu bệnh phẩm bằng nested PCR đã cho thấy tỷ lệ các mẫu dương tính với chủng mang gene CagA chiếm tỷ lệ cao, lên tới 90%.
Kỹ thuật nested real-time PCR cũng được ứng dụng để nghiên cứu nhằm xác định gene mã hóa chất gây dị ứng có trong các thực phẩm có hạt điều (Costa và cộng sự, 2022). Kỹ thuật này đạt độ nhạy cao với 10 mg/kg hạt điều trong bột/bánh quy mà không bị ảnh hưởng bởi nhiệt khi xử lý bánh. Vì vậy nested real-time PCR được đề xuất làm công cụ định lượng/xác nhận để phân tích chất gây dị ứng trong thực phẩm chứa hạt điều.
