Định tuýp HPV bằng kỹ thuật xét nghiệm Reverse Dot Blot (RDB)

Ước tính mỗi người phụ nữ sẽ mắc phải ít nhất 1 loại HPV trong đời. Tuy nhiên, không phải loại HPV nào cũng gây bệnh và không phải loại HPV gây bệnh nào cũng có thể dẫn đến ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm tầm soát virus HPV, sàng lọc ung thư cổ tử cung giúp giảm tới 70% tỉ lệ mắc phải. Bằng phương pháp reverse dot blot, ABT mang đến một giải pháp sàng lọc định tuýp HPV hiệu quả hỗ trợ đắc lực cho việc xác định và điều trị, có thể phát hiện cùng lúc lên đến 35 tuýp HPV đặc hữu và phổ biến ở khu vực châu Á.

Tổng quan về HPV

Virus HPV hay còn được gọi với tên La Tinh là Human Papilomavirus, là một virus thuộc họ Papovaviridae, lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất có thể gây ra một số bệnh ung thư và mụn cóc sinh dục. Khoảng 80% đàn ông và phụ nữ có hoạt động tình dục bị nhiễm HPV vào một thời điểm nào đó trong đời và hầu hết các ca nhiễm mới là ở những người ở độ tuổi thanh thiếu niên và những năm 20 tuổi đầu. Hầu hết người bệnh sẽ không có triệu chứng và có thể không bao giờ biết họ có virus, nhưng trong khi bị nhiễm virus có thể lây lan.

Bộ gen của papillomavirus là một phân tử DNA hình tròn sợi đôi có chiều dài xấp xỉ 8.000 bp. Nó không có lớp màng lipid bao bọc và được cấu tạo từ 1 protein duy nhất tên là L1, đóng vai trò hình thành vỏ capsid dày 55-60 nm gồm 72 capsomer hình ngôi sao. Lớp vỏ L1 cùng với các protein histone của tế bào, dùng để bao bọc và cô đặc DNA.

Một số thông tin thêm về HPV:

• HPV phổ biến đến mức khoảng 4/5 người chưa được tiêm phòng sẽ bị nhiễm HPV vào một thời điểm nào đó trong đời.
• Trước khi vắc-xin HPV được giới thiệu, khoảng 340.000 đến 360.000 phụ nữ và nam giới bị ảnh hưởng bởi mụn cóc sinh dục do HPV gây ra mỗi năm
• Hàng năm, khoảng 11.000 phụ nữ sống ở Mỹ sẽ được chẩn đoán và hơn 4.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung. Khoảng 21.000 phụ nữ và 15.000 nam giới bị ảnh hưởng hàng năm bởi các bệnh ung thư do HPV gây ra.
• Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ước tính có 43 triệu ca nhiễm HPV ở Hoa Kỳ vào năm 2018, bao gồm 13 triệu ca nhiễm mới

Chẩn đoán và sàng lọc HPV

Các biện pháp khám sàng lọc phổ biến nhất hiện nay là

• Xét nghiệm tế bào học (Pap smear)
• Quan sát tế bào ung thư cổ tử cung bằng phương pháp nhuộm (LBC)
• Xét nghiệm HPV-DNA

Bệnh nhân nếu muốn xét nghiệm sàng lọc để phát hiện sớm ung thư cổ tử cung thì nên chọn HPV-DNA, vì phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời có thể định type để biết hướng điều trị, bệnh nhân không phải lấy mẫu lại nhiều lần. Hiện tại ABT có cung cấp bộ kit TopSENSI® HPV qPCR KIT (SQH-103) cho các xét nghiệm HPV-DNA bằng kĩ thuật Realtime PCR cho kết quả chính xác, nhanh chóng.

HPV có bao nhiêu loại ?

Hiện nay có hơn 150 type HPV, trong đó 40 type ảnh hưởng đến vùng sinh dục, nhưng hầu hết không gây nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe. Một người có thể bị nhiễm nhiều hơn một type HPV cùng một lúc. Các type được xác định theo số lượng và thuộc một trong hai loại sau.

Low-risk HPV

Hầu hết các type HPV sinh dục nguy cơ thấp không gây ra các triệu chứng và biến mất khi cơ thể hình thành khả năng miễn dịch với virus. Những type này không liên quan đến ung thư nhưng có thể dẫn đến mụn cóc sinh dục. Ngoài âm hộ và dương vật, mụn cóc có thể xuất hiện trên cổ tử cung hoặc âm đạo ở phụ nữ, bìu ở nam giới hoặc trong và xung quanh hậu môn ở nam giới hoặc phụ nữ. Mụn cóc cũng có thể xuất hiện trong miệng và cổ họng.

Hai type HPV, loại 6 và 11, gây ra 90% các mụn cóc này. Chỉ có khoảng 1% người Mỹ có hoạt động tình dục có mụn cóc sinh dục đáng chú ý, cần điều trị để ngăn ngừa lây lan sang các vùng sinh dục khác và cho bạn tình. Một số type HPV nguy cơ thấp có thể gây ra chứng loạn sản cổ tử cung nhẹ, những thay đổi bất thường trong các tế bào trên bề mặt cổ tử cung. Những thay đổi này không phải là tiền ung thư.

High-risk HPV

Nhiễm HPV nguy cơ cao có thể dẫn đến chứng loạn sản cổ tử cung lan rộng hơn và một số loại ung thư. Có ít nhất 12 type HPV có nguy cơ cao, nhưng chỉ có hai loại—loại 16 và 18—gây ra phần lớn các bệnh ung thư liên quan đến HPV, bao gồm những bệnh liên quan đến cổ tử cung, âm đạo, âm hộ, dương vật và hậu môn.

Các type HPV nguy cơ cao cũng có thể dẫn đến ung thư cổ họng, lưỡi và amidan, được gọi là ung thư hầu họng. Các nhà nghiên cứu tin rằng nhiễm trùng HPV ở miệng và cổ họng có thể do quan hệ tình dục bằng miệng với người đang bị nhiễm trùng nguy cơ cao. Tuy nhiên, điều quan trọng cần nhớ là đối với hầu hết mọi người, hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ virus HPV khỏi cơ thể trong vòng hai năm. Mặc dù nhiễm các type HPV nguy cơ cao có thể gây ung thư, nhưng hầu hết những người bị nhiễm các type này không phát triển thành ung thư.

RDB là gì?

Reverse Dot Blot (RDB), tiếng Việt là lai điểm ngược là một kĩ thuật trong đó các đầu dò (probe) oligonucleotide đặc hiệu của allele hoặc gene mục tiêu được gắn với màng lai thay vì sản phẩm PCR và DNA khuếch đại được đánh dấu trong quá trình PCR được sử dụng để lai với dãy probe cố định.

Định tuýp HPV bằng RDB

Phương pháp lai điểm ngược (reverse dot-blot) là một quy trình chẩn đoán đơn giản và nhanh chóng, cho phép sàng lọc mẫu để tìm nhiều loại đột biến/đa hình trong một phản ứng lai đơn. Một số phương pháp cố định các mẫu dò oligonucleotide đã được đưa ra.

Phương pháp lai điểm ngược có một số đặc tính độc đáo có giá trị trong việc thiết lập chẩn đoán:

(1) nhiều kết quả định type từ một mẫu đơn lẻ có thể được hiện diện trên một màng lai. Điều này giúp cho hoạt động trượt và tìm kiếm trình tự của đầu dò thuận lợi và giảm thiểu khả năng xảy ra lỗi của kỹ thuật viên.

(2) Có sẵn màng lai cho định type. Điều này giảm thiểu thao tác thủ công của kỹ thuật viên cũng như khả năng xảy ra lỗi và có thể dùng chất chuẩn.

(3) Không giống như định type bằng dot-blot/oligonucleotide, chỉ sản phẩm PCR được gắn biotin mới xảy ra phản ứng lai, do đó loại bỏ vấn đề tiềm ẩn của các probe gắn biotin không đặc hiệu. Phương pháp này đã được sử dụng trong các lĩnh vực xác định gene pháp y (xét nghiệm HLA-DQα Amplitype), xác định loại mô để cấy ghép (xét nghiệm HLA-DRβ), sàng lọc xơ nang, cũng như trong nhiều nghiên cứu ứng dụng khác nhau.

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến của 1 loại bệnh như β-thalassemia, đột biến kháng thuốc lao, định type HPV, …  Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm xác định sự đồng nhiễm của 32 type HPV phổ biến tại việt Nam (Human papillomavirus). Trong đó bao gồm:

Bộ kit có khả năng nhận diện 35 genotype HPV bao gồm:

12 genotype HPV nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59.

10 genotype HPV có khả năng nguy cơ cao: 26, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82.

13 genotype HPV nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 64, 71, 72, 81, 83. Thành phần và vai trò của hóa chất trong bộ kit TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT:

RBD1	NaOH	Sử dụng để làm biến tính DNA pH [25-29]. Ở pH kiềm, các nhóm OH- chiếm ưu thế. Chúng loại bỏ các proton tạo ra liên kết hydro khỏi guanin và thymine, do đó phá vỡ các liên kết hydro giữa hai oligonucleotide.
RBD6	RDB2: 0.15 M NaCl và 0.015 M sodium citrate	Tạo môi trường ion phù hợp cho phản ứng lai.
RBD6	RBD3: 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).	Kết tủa trong điều kiện lạnh cần phải rã đông trước khi sử dụng. SDS khiến mạch DNA đơn duỗi ra làm giảm cấu trúc bậc 2 để đoạn gen dễ dàng lai vào mẫu dò.
RBD6	Nước cất 2 lần.	Tạo môi trường thích hợp để đoạn gen đích lai với mẫu dò đã được cố định trên màng lai đồng thời rửa trôi các liên kết không đặc hiệu.
RDB4	Streptavidin-HRP	–         Streptavidin có ái lực cao với phân tử biotin. Streptavidin HRP là một cộng hợp protein streptavidin liên hợp với HRP. –         HRP là 1 peroxidase enzyme. Tùy thuộc vào cơ chất mà phản ứng giữa enzyme HRP và cơ chất sẽ tạo ra màu sắc khác nhau.
RBD5	–         Tris-HCl 0,1M pH 9,5 –         NaCl –         MgCl2	–         Là môi trường thích hợp để phản ứng hiện màu diễn ra. –         Đảm bảo pH thích hợp và cung cấp cofactor Mg+ cho enzyme hoạt động.
TMB		–         TMB là cơ chất của Streptavidin-HRP. Khi TMB liên kết với Streptavidin-HRP sẽ tạo ra phản ứng màu xanh. –         TMB rất nhạy cảm với ánh sáng do đó cần tránh ánh sáng khi thực hiện thao tác với TMB. –         Không để nắp chai bảo quản mở trong thời gian kéo dài vì TMB nhạy cảm với các tác nhân oxi hóa. –         TMB bị đông đá trong điều kiện lạnh. Cần chú ý rã đông hoàn toàn trước khi hút.

Một số hình ảnh kết quả thực tế khi lai RDB bằng bộ kit TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT: