Trong nuôi tôm công nghiệp, EHP (has become a major concern for the shrimp farming industry) gây bệnh chậm lớn và VPAHPND (Vibrio parahaemolyticus) gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp là hai tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng, thường tồn tại ở nồng độ thấp trong giai đoạn sớm và khó phát hiện bằng các phương pháp truyền thống.
PCR kỹ thuật số vi giọt (droplet digital PCR – ddPCR) đang được xem là công nghệ tiềm năng nhờ khả năng phát hiện mục tiêu với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Bài viết này đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của ddPCR nhằm phát hiện EHP và VPAHPND ở tôm. Từ đó giúp xác định hiệu quả của một phương pháp xét nghiệm nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán dịch bệnh thủy sản.
Bài viết tham khảo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Zhang và cộng sự (2022) trên tạp chí Journal of Fish Diseases [1]
1. ddPCR là gì?
Droplet digital PCR (ddPCR) là kỹ thuật PCR thế hệ mới, trong đó phản ứng được phân tách thành hàng chục nghìn vi giọt, cho phép định lượng tuyệt đối DNA/RNA mục tiêu mà không cần đường chuẩn. Điều này giúp ddPCR đặc biệt phù hợp cho các mẫu thủy sản có nền phức tạp và nồng độ mầm bệnh thấp.
2. Phương pháp đánh giá độ đặc hiệu của ddPCR
Specificity phản ánh khả năng phát hiện chính xác tác nhân mục tiêu mà không phát hiện các trình tự tương tự khác có trong mẫu.
Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp PCR kỹ thuật số vi giọt trong việc phát hiện EHP và VPAHPND, mẫu tôm nhiễm các tác nhân gây bệnh khác nhau được thu thập bao gồm:
PC – Chứng dương
1. WSSV (White Spot Syndrome Virus) – virus gây bệnh đốm trắng
2. TSV (Taura Syndrome Virus) – virus gây hội chứng Taura
3. YHV(Yellow Head Virus) – virus gây bệnh đầu vàng
4. VH (Vibrio harveyi) – vi khuẩn gây bệnh phát sáng và nhiễm trùng đường ruột
5. DIV1 (Decapod Iridescent Virus 1) – virus DNA nguy hiểm gây ra bệnh DIV1
6. VP (Vibrio parahaemolyticus) – vi khuẩn không mang gen độc tố (Non-AHPND) gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
7. NHPB (Necrotizing Hepatopancreatitis Bacterium) – vi khuẩn gây bệnh đốm đen
8. IHHNV (Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus) – virus gây ra bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm.
9. EHP (Enterocytozoon hepatopenaei) – vi bào tử trùng gây ra bệnh còi cọc trên tôm
10. VPAHPND (Vibrio parahaemolyticus) – vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
NC – Nước cất hai lần – đối chứng âm
Các mẫu không chứa mục tiêu EHP và VPAHPND nhằm đánh giá khả năng phản ứng chéo của phương pháp. Mỗi phản ứng ddPCR được lặp lại hai lần để đảm bảo độ chính xác và tính lặp lại của thí nghiệm.
(a) tín hiệu của EHP kênh Ch1 (b) tín hiệu của VPAHPND kênh Ch2. Đường màu hồng ngưỡng phân biệt dương tính và âm tính.
Kết quả cho thấy: chứng dương (PC) ở cả 2 thử nghiệm đều cho kết quả dương tính và chứng âm (NC) đều âm tính không ghi nhận tín hiệu.
Mẫu tôm nhiễm EHP (hình 1a – Lane 9) và VPAHPND (hình 1b – Lane 10) cho kết quả dương tính rõ ràng với tín hiệu vượt ngưỡng trong đồ thị.
Các mẫu còn lại bao gồm cả chủng VP không độc lực (Mẫu 6) và các tác nhân như WSSV, TSV, YHV, DIV1 hay IHHNV, đều không ghi nhận tín hiệu. Điều này cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, không xảy ra phản ứng chéo trong phát hiện EHP và VPAHPND trên tôm.
3. Phương pháp đánh giá độ nhạy của ddPCR
Analytical sensitivity là khả năng phát hiện được nồng độ rất thấp một mục tiêu có trong mẫu. Chỉ số này thường được biểu thị bằng giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) tức là nồng độ thấp nhất của mục tiêu mà xét nghiệm có thể phát hiện được một cách ổn định, thường đạt tỷ lệ ≥95% số mẫu.
Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật ddPCR trong phát hiện đồng thời EHP và VPAHPND, gene SWP1 của EHP và gene pirA của VPAHPND được tổng hợp và nối vào vector pUC57 tạo thành hai plasmid pUC57-EHP và pUC57-VPAHPND.
Các plasmid này được pha loãng bậc 10 bằng dung dịch TE 1X để tạo dải nồng độ chuẩn gồm:
| pUC57-EHP (chấm xanh dương) | pUC57-VPAHPND (chấm xanh lá) |
| 2.6×104 copies/ μL (Lane 1 & 2) 2.6×103 copies/ μL (Lane 3 & 4) 2.6×102copies/ μL (Lane 5 & 6) 2.6×101 copies/ μL (Lane 7 & 8) 2.6×100 copies/ μL (Lane 9 & 10) Chứng âm (Lane 11 & 12) | 5×104 copies/μL (Lane 1 & 2) 5×103 copies/μL (Lane 3 & 4) 5×102 copies/μL (Lane 5 & 6) 5×101 copies/μL (Lane 7 & 8) 5×100 copies/μL (Lane 9 & 10) Chứng âm (Lane 11 & 12) |
Mỗi nồng độ được phân cách bằng các đường màu vàng và lặp lại hai lần để xác định giới hạn phát hiện (LOD). Sau đó, nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được được lặp lại 8 lần nhằm xác nhận độ nhạy phân tích của ddPCR.
Ngoài ra, các độ pha loãng tương tự cũng được thực hiện với mẫu DNA tôm không nhiễm EHP và VPAHPND để đánh giá xem DNA trong mẫu tôm có ảnh hưởng đến độ nhạy của ddPCR hay không.
Phương pháp ddPCR cho thấy giới hạn phát hiện của ddPCR đối với EHP khi pha loãng TE là 2.6 copies/μL (Lane 10) và khi pha loãng với DNA tôm là 2.3 copies/μL (Lane 10). Tương tự, VPAHPND có thể được phát hiện ở nồng độ thấp nhất là 3.7 copies/μL khi pha với TE 1X và pha loãng với DNA tôm là 4.6 copies/μL. Điều này chứng minh ddPCR có độ nhạy cao phát hiện EHP và VPAHPND ở nồng độ thấp, nền mẫu khác nhau không ảnh hưởng đến độ nhạy của thử nghiệm.
(a) Độ nhạy với EHP; (b) Độ nhạy với VPAHPND; (c) Đường chuẩn của EHP; (d) Đường chuẩn với VPAHPND
So sánh với phương pháp Real-time PCR định lượng, EHP chỉ được phát hiện ở ngưỡng thấp nhất là 2.6 × 10¹ copies/μL (Hình 3a đường màu vàng) và VPAHPND từ 5.0 × 10¹ copies/μL trở lên (Hình 3b đường màu vàng). Các phản ứng qPCR đều có hệ số tuyến tính (R²) > 0.999 chứng tỏ độ chính xác và tuyến tính cao. Trong nghiên cứu này, ddPCR cho độ nhạy cao hơn qPCR ở các nồng độ thấp.
Không chỉ có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ddPCR không cần đường chuẩn để định lượng tuyệt đối nhưng vẫn cần kiểm soát chất lượng và hiệu chuẩn hệ thống. ddPCR ít nhạy cảm với chất ức chế hơn so với qPCR trong một số trường hợp. Ưu điểm chính của ddPCR là khả năng định lượng tuyệt đối (absolute quantification) và phát hiện mầm bệnh ở nồng độ cực thấp (low copy detection) có trong mẫu. Với những ưu điểm vượt trội, ddPCR đang trở thành xu hướng công nghệ xét nghiệm hiện đại trong ngành thủy sản, góp phần nâng cao hiệu quả và an toàn sinh học trong nuôi tôm công nghiệp.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ddPCR có lợi thế trong việc phát hiện mầm bệnh ở nồng độ thấp trong một số điều kiện. Đây là nền tảng quan trọng cho việc ứng dụng công nghệ hiện đại vào quản lý và giám sát sớm dịch bệnh trong nuôi tôm công nghiệp.
4. Tài liệu tham khảo
Zhang, H., Gong, H. Y., Cao, W. W., Que, M. Y., Ye, L., & Shi, L. (2022). Duplex droplet digital PCR method for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei and Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease. Journal of fish diseases, 45(6), 761–769. https://doi.org/10.1111/jfd.13600.