PCR là một kỹ thuật được nhắc đến nhiều gần đây trong xét nghiệm chẩn đoán y học, đặc biệt trong xét nghiệm chẩn đoán covid-19. Phương pháp xét nghiệm PCR sử dụng trong phòng thí nghiệm với mục đích để nhân bản hàng triệu bản sao của một đoạn DNA mục tiêu. Vậy nguyên tắc hoạt động chính của PCR là gì? Và ứng dụng chính của xét nghiệm PCR trong chẩn đoán y học gồm những gì?
PCR là gì?
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật nhanh chóng và hiệu quả được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu có kích thước nhỏ tạo ra hàng triệu bản sao của DNA. Nói cách khác, PCR cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một chuỗi DNA cụ thể từ một mẫu nhỏ ban đầu hay thậm chí là một bản sao duy nhất.
PCR được xem là một quá trình quan trọng đối với một loạt các công nghệ di truyền trong nghiên cứu y học và sinh học. Đặc biệt trong các xét nghiệm sinh học phân tử, PCR là 1 quá trình không thể thiếu giúp con người nghiên cứu sâu vào phân tích vật liệu di truyền DNA/RNA.
Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện dựa trên nguyên tắc khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình luân nhiệt (có thể 20-40 chu kỳ) gồm 3 bước:
+ Biến tính (Denaturation 950C): tách rời DNA mạch đôi thành mạch đơn bằng nhiệt.
+ Bắt cặp (Annealing 400C – 700C) cho phép sự bắt cặp giữa mồi với khuôn mẫu DNA.
+ Kéo dài (Elongation 720C) mạch mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung nhờ DNA polymerase
Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng khuếch đại
Khi thiết lập 1 phản ứng PCR, bất kể đối với mẫu DNA nào đều yêu cầu các thành phần sau:
– Khuôn DNA.
– Mồi (Primer): Là trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu 3’ của đoạn DNA cần nhân bản sao. Mồi được dùng theo từng cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược tính theo chiều phiên mã. Mồi xuôi có trình tự nucleotide cùng chiều với sợi mang mã, mồi ngược có trình tự nucleotide bổ sung với sợi mang mã của đoạn DNA cần nhân bản sao.
– dNTP (deoxynucleotide triphosphate): dNTP là hỗn hợp gồm 4 thành phần cần cho sự tổng hợp DNA là dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
– DNA polymerase: enzym có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu với đặc điểm chịu nhiệt, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao của bước biến tính.
– Dung dịch đệm ( buffer): thành phần Tris-HCl pH 8,3 ; KCl, MgCl2 và Gelatin. Dung dịch đệm có vai trò trong việc tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của DNA polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh mẽ đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR .
Một phản ứng PCR hoàn chỉnh có thể được thực hiện trong vài giờ, hoặc thậm chí ít hơn một giờ với một số máy tốc độ cao nhất định.
Sau khi phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong máy luân nhiệt, một phương pháp gọi là điện di trên gel agarose có thể được sử dụng để kiểm tra số lượng và kích thước của các đoạn DNA được tạo ra.
Ứng dụng của PCR trong chẩn đoán y khoa?
Kỹ thuật xét nghiệm PCR là một công cụ chẩn đoán tuyệt vờicho phép con người nhân lên cả triệu đoạn DNA (RNA) trong thời gian rất ngắn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ứng dụng trong chẩn đoán y học bao gồm:
+ Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm trên người: Dựa trên cơ sở phát hiện vi khuẩn hoặc virus lây nhiễm như HIV, bệnh lao (TB), Viêm gan B (HBV), Viêm gan C (HCV) Ung thư cổ tử cung (HPV)…
+ Chẩn đoán các bệnh di truyền, Sửa đổi các đoạn DNA.
+ Phân tích pháp y: Xác định dấu vân tay di truyền, xét nghiệm DNA, quan hệ huyết thống, điều tra tội phạm..
+ Dòng hóa DNA: Cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các bản sao giống hệt nhau của một đoạn DNA, nghiên cứu sự biểu hiện gen
Ngoài lĩnh vực y học, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh trong đa dạng lĩnh vực khác bao gồm: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm, định danh,..
Hiện nay, công ty TNHH GIẢI PHÁP Y SINH ABT là 1 doanh nghiệp hàng đầu áp dụng phương pháp PCR, Real-time PCR thành công trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh. Để biết thêm thông tin chi tiết về kỹ thuật xét nghiệm này, cũng như khám phá các bộ kit chẩn đoán của ABT trong Y học:
