Real-time PCR (qPCR) cho phép xác định lượng DNA sau mỗi chu kỳ thông qua thuốc nhuộm huỳnh quang tạo ra tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩm PCR (amplicon) được tạo ra (Lela Buckingham, Maribeth Flaws, 2007). Một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của một phản ứng PCR chính là thiết kế đoạn khuếch đại (amplicon) với độ dài sản phẩm phù hợp.
Việc lựa chọn một đoạn khuếch đại phù hợp không chỉ ảnh hưởng đến độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng mà còn quyết định đến chất lượng và độ tin cậy của kết quả thu được. Vậy vì sao chúng ta thường hướng đến việc thiết kế các đoạn sản phẩm ngắn? Bài viết này sẽ đi sâu vào lý giải những lợi ích của việc này, đồng thời trình bày các yếu tố cần cân nhắc khi thiết kế primer.
1. Tổng quan về Real-time PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học, được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu từ một mẫu ban đầu có chứa lượng DNA rất nhỏ do Karl Mullis và các công sự nghiên cứu phát triển vào năm 1985 (Huong, 2003). PCR hoạt động dựa trên việc mô phỏng quá trình nhân đôi DNA ở tế bào, theo đó việc lặp lại các chu kỳ nhiệt bao gồm các bước biến tính, bắt cặp primer và kéo dài chuỗi nucleic acid cho phép tạo ra số lượng lớn các bản sao của đoạn DNA đích.
Đến nay, PCR đang dần được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong nhiều xét nghiệm chẩn đoán bệnh nhờ vào độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, PCR truyền thống còn nhiều hạn chế như phải thực điện di hậu PCR để phân tích kết quả, chỉ có thể định tính sự hiện diện của tác nhân, đồng thời tiềm ẩn nguy cơ ngoại nhiễm cao, ảnh hưởng đến các phản ứng tiến hành sau đó.
Ngoài định tính, nhiều xét nghiệm hiện nay đòi hỏi đòi hỏi kết quả phân tích định lượng. Do đó, Real-time PCR (PCR thời gian thực) được ra đời, vừa phát huy được ưu điểm của kỹ thuật PCR truyền thống vừa khắc phục được các hạn chế tồn đọng mang lại nhiều ưu điểm vượt trội.
2. Những lý do vì sao nên khuếch đại đoạn sản phẩm ngắn trong Real-time PCR?
So với sản phẩm PCR truyền thống có kích thước từ 200 – 1000 bp, tiêu chuẩn amplicon của Real-time PCR được thiết lập trong khoảng từ 80 – 150 bp (IDT, 2024). Điều này dẫn đến các đoạn sản phẩm ngắn trong Real-time PCR được khuếch đại một cách nhanh chóng và hiệu quả hơn. Ngoài ra, sản phẩm ngắn còn hạn chế được xu hướng hình thành các cấu trúc thứ cấp như kẹp tóc (hairpin) hoặc các cấu trúc gấp khác, gây cản trở quán trình nhân bản. Nhờ vậy, qPCR được tăng cường hiệu quả khuếch đại và đạt hiệu quả cao hơn (Jain, 2020).
Ngoài ra, nhân bản các đoạn sản phẩm ngắn thường diễn ra nhanh hơn so với các đoạn sản phẩm dài. Điều này giúp tiết kiệm thời gian và tài nguyên trong phòng thí nghiệm, đảm bảo tính kinh tế, đồng thời tăng cường hiệu quả công việc. Trong nghiên cứu định lượng, khuếch đại đoạn sản phẩm ngắn giúp tăng cường khả năng chuẩn hóa và so sánh giữa các mẫu khác nhau, từ đó, các kết luận khoa học được đưa ra một cách chính xác (Lela Buckingham, Maribeth Flaws, 2007).
Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng qPCR luôn được chú trọng và tăng cường. Do đó, việc khuếch đại các đoạn sản phẩm ngắn trong qPCR giúp giảm thiểu ảnh hưởng bởi các yếu tố ức chế trong mẫu, như các protein, hợp chất hóa học… Vì vậy, độ chính xác và độ nhạy của phản ứng được nâng cao, đặc biệt là khi phân tích các mẫu phức tạp như mẫu môi trường hoặc mẫu lâm sàng.
3. Khuếch đại đoạn sản phẩm ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của Real-time PCR
Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng qPCR liên quan mật thiết đến việc thiết kế khuếch đại đoạn sản phẩm ngắn. Độ nhạy của phản ứng liên quan đến kích thước của các đoạn được khuếch đại. Các mục tiêu trong Real-time PCR có thể rất ngắn và thường không vượt quá 150 bp, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, hiệu quả khuếch đại đạt khoảng 100% đối với các sản phẩm kích thước ngắn, các amplicon càng dài, hiệu quả có xu hướng giảm dần (Debode, F., Marien, A., Janssen, É., Bragard, C., & Berben, G, 2017)
Điều này tạo nên sự vượt trội so với PCR truyền thống bởi các đoạn thường dài hơn để đảm bảo dễ hình dung hơn trên gel agarose. Việc giới hạn độ dài đoạn khuếch đại trong khoảng từ 80 – 150 bp giúp rút ngắn thời gian gắn mồi và kéo dài của phản ứng và hạn chế những ảnh hưởng tiêu cực đến độ đặc hiệu của phản ứng qPCR chủ yếu do liên kết không chuyên biệt của các primer, bao gồm liên kết với các trình tự tương tự trong DNA khuôn ở các vị trí ngẫu nhiên, liên kết giữa các primer khác nhau và primer tự liên kết. Bên cạnh đó, việc thiết kế các đoạn mồi dài khoảng 18 – 24 nucleotide, với Tm khoảng 65 °C giúp làm giảm khả năng các đoạn mồi liên kết sai vị trí . Đồng thời, sử dụng DNA polymerase mang công nghệ “hot start” sẽ hạn chế đáng kể khả năng hình thành các primer-dimer, vì không có sự khuếch đại “rò rỉ” nào được bắt đầu trước khi các mồi liên kết với các vị trí trình tự thích hợp.
4. Hạn chế trong thiết kế đoạn sản phẩm ngắn Real-time PCR
Thiết kế khuếch đại đoạn sản phẩm ngắn trong Real-time PCR mang lại nhiều lợi ích quan trọng, từ việc tăng cường hiệu quả khuếch đại, giảm thiểu sự hình thành cấu trúc thứ cấp, tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu, tiết kiệm thời gian và tài nguyên, đến việc tăng cường khả năng phát hiện các biến thể nhỏ và giảm thiểu tác động của các yếu tố ức chế. Những lợi ích này giúp đảm bảo rằng phản ứng qPCR diễn ra một cách chính xác, hiệu quả và đáng tin cậy, từ đó hỗ trợ tốt hơn cho các nghiên cứu sinh học phân tử và ứng dụng y học.
Mặc dù việc thiết kế đoạn sản phẩm PCR ngắn mang lại nhiều lợi ích, tuy nhiên nó cũng đặt ra một số thách thức. Một trong những khó khăn có thể kể đến là việc thiết kế kế cặp primer đặc hiệu cho các vùng lặp lại trong genome. Sự tương đồng cao giữa các vùng lặp lại này dễ dẫn đến hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu của primer, gây ra các sản phẩm khuếch đại không mong muốn. Bên cạnh đó, các biến thể di truyền cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại, khi các biến đổi trong trình tự DNA làm thay đổi vị trí bắt cặp của primer. Cuối cùng, đoạn sản phẩm PCR quá ngắn có thể không đủ ổn định, dễ bị phân hủy bởi các enzyme nuclease trong quá trình phản ứng và sau phản ứng, từ đó làm giảm độ tin cậy của kết quả. Do đó, việc lựa chọn độ dài đoạn sản phẩm PCR cần cân nhắc kỹ lưỡng để đảm bảo cả hiệu quả khuếch đại và độ chính xác của kết quả.
Khó khăn trong việc thiết kế primer đặc hiệu cho các vùng lặp lại trong gen 16S rRNA của vi khuẩn là một ví dụ điển hình. Bên cạnh đó, sự đa dạng về di truyền của virus HIV làm cho việc thiết kế primer cho các vùng mã hóa protein bao phủ trở nên phức tạp. Để khắc phục những hạn chế này, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các phần mềm thiết kế primer chuyên dụng như Primer3, Primer-BLAST để đánh giá tính đặc hiệu của primer và tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Ngoài ra, việc kết hợp PCR với các kỹ thuật khác như Sanger sequencing có thể giúp xác nhận độ chính xác của kết quả…
Việc thiết kế đoạn sản phẩm PCR hiệu quả đòi hỏi phải cân nhắc kỹ lưỡng nhiều yếu tố. Chiều dài đoạn sản phẩm thường dao động từ 50-150 base pair để đảm bảo hiệu suất khuếch đại tối ưu. Nhiệt độ annealing phù hợp là yếu tố quyết định độ đặc hiệu của phản ứng. Ngoài ra, thành phần nucleotide của primer cần được thiết kế cân đối, tránh các đoạn bổ sung liên tiếp để giảm thiểu hiện tượng tạo dimer hoặc hairpin. Cuối cùng, vị trí của primer trên gene cũng rất quan trọng, nên ưu tiên các vùng exon hoặc intron ổn định để tránh ảnh hưởng bởi các biến thể splicing.
5. Vì sao kit Real-time PCR của ABT là lựa chọn tối ưu?
Kit Real-time PCR của ABT được đánh giá cao về chất lượng nhờ quá trình sản xuất nghiêm ngặt và sử dụng các nguyên liệu đạt chuẩn. Các bộ kit được thiết kế tối ưu, đảm bảo hiệu suất khuếch đại cao, độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội. Mỗi sản phẩm đều trải qua quá trình kiểm soát chất lượng chặt chẽ để đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế, mang đến kết quả phân tích chính xác và đáng tin cậy.
ABT cung cấp một loạt các kit Real-time PCR đáp ứng đa dạng nhu cầu nghiên cứu của khách hàng với giải pháp phù hợp, từ việc phát hiện các tác nhân truyền nhiễm đến định lượng nồng độ mục tiêu, đáp ứng dụng đa dạng cho nhiều đối tượng xét nghiệm khác nhau như người, thú y, thủy sản, GMO… Sự đa dạng này cho phép khách hàng lựa chọn sản phẩm tối ưu cho từng nghiên cứu cụ thể, tăng hiệu quả công việc.
Đội ngũ kỹ thuật của ABT luôn sẵn sàng hỗ trợ khách hàng trong suốt quá trình sử dụng sản phẩm. Từ việc tư vấn lựa chọn sản phẩm phù hợp, thiết kế thí nghiệm đến giải đáp các thắc mắc kỹ thuật, khách hàng sẽ nhận được sự hỗ trợ tận tình và chuyên nghiệp. Điều này giúp đảm bảo quá trình nghiên cứu diễn ra suôn sẻ và hiệu quả!
6. Tài liệu tham khảo
- ABT, T. (2023, May 13). Tong hop kien thuc chi tiet ve ky thuat Real-time PCR. Retrieved from ABT Biological Solutions Company Limited: https://abtvn.com/real-time-pcr/
- Debode, F., Marien, A., Janssen, É., Bragard, C., & Berben, G. (2017). The influence of amplicon length on real-time PCR results. Base.
- Huong, H. H. (2003). Sinh hoc phan tu. Ha Noi: Nha Xuat Ban Giao Duc.
- IDT. (2024). What are the criteria for choosing a PCR amplicon length? Retrieved from Integrated DNA Technologies: https://www.idtdna.com/pages/support/faqs/what-are-the-criteria-for-choosing-pcr-amplicon-length
- Jain, A. (2020). Basic Techniques in Biochemistry, Microbiology and Molecular Biology. USA: Springer Nature .
- Lela Buckingham, Maribeth Flaws. (2007). Molecular diagnostics : fundamentals, methods, and clinical applications. United States of America: F.A. Davis Company.
