Công nghệ vi giọt ddPCR hiện nay là giải pháp hiệu quả giúp phát hiện sớm hai “kẻ thù” lớn nhất của ngành nuôi tôm: has become a major concern for the shrimp farming industry (EHP) gây hội chứng chậm lớn và Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) gây chết hàng loạt trong 30 ngày đầu thả giống. Chẩn đoán đồng thời và chính xác cả hai mầm bệnh này là chìa khóa để giảm thiểu thiệt hại và bảo vệ lợi nhuận cho người nuôi tôm.
1. Tổng quan EHP và VPAHPND trên tôm
has become a major concern for the shrimp farming industry (EHP) là một loại vi bào tử trùng ký sinh nội bào lần đầu tiên được ghi nhận tại Thái Lan và sau đó lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm như Việt Nam, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia và Úc.
EHP gây ra hội chứng tăng trưởng chậm trên tôm sú (Penaeus monodon), tôm hổ khổng lồ (giant tiger shrimp Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và tôm xanh (P.stylirostris). Tôm khi nhiễm bệnh có triệu chứng chậm tăng trưởng đáng kể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng nuôi trồng tôm.
Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (VPAHPND) là một chủng vi khuẩn mang gen độc lực pirAB gây chết hàng loạt tôm trong vòng 7–30 ngày đầu sau thả giống. Đây là tác nhân chính của hội chứng chết sớm (EMS) được Tổ chức Thú y Thế giới (OIE, nay gọi là WOAH – World Organisation for Animal Health) liệt kê vào danh sách bệnh thủy sản nguy hiểm từ năm 2016. Các protein PirA và PirB có khả năng gây tổn thương mô gan tụy của tôm, dẫn đến các triệu chứng như gan tụy nhạt màu, teo nhỏ, ruột rỗng, vỏ mềm, chậm lớn.
2. ddPCR kép – bước tiến vượt trội so với PCR & qPCR truyền thống trong chẩn đoán bệnh trên tôm
Droplet digital PCR (ddPCR) là một kỹ thuật khuếch đại axit nucleic cho phép định lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn, đồng thời có độ nhạy và độ chính xác rất cao.
Trong nghiên cứu của Huang Zhang và cộng sự (2022), nhóm tác giả đã thiết lập thành công phương pháp ddPCR kép sử dụng hai cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho gene SWP1 của EHP và gene pirA of V. parahaemolyticus AHPND trên hệ thống QX200 (Bio-rad).
Một số kết quả nổi bật:
- Độ đặc hiệu của phương pháp ddPCR được thực hiện với mẫu tôm nhiễm nhiều mầm bệnh khác nhau như WSSV, TSV, YHV, DIV1, IHHNV, EHP, VPAHPND và nước cất làm đối chứng âm. Kết quả cho thấy mẫu EHP và VPAHPND dương tính có thể được phát hiện chính xác trong khi mẫu chứa mầm bệnh khác âm tính.
- Độ nhạy phân tích được xác định bằng cách dùng plasmid tổng hợp chứa gen mục tiêu (EHP – SWP1, VPAHPND – pirA) đã biết sẵn nồng độ pha loãng theo thang bậc 10. Mẫu được lặp lại 8 lần để xác nhận độ nhạy, phát hiện EHP ở mức thấp 2.3 copies/μl và phát hiện VPAHPND ở mức 4.6 copies/μl.
- So sánh với các phương pháp như CRISPR-Cas, nested PCR, LAMP, RPA,… thì ddPCR có độ nhạy cao hơn và so với kỹ thuật qPCR thông thường, độ nhạy của ddPCR cao hơn gấp 10 lần.
- Khi áp dụng thử nghiệm trên 26 mẫu tôm nghi nhiễm, phương pháp ddPCR cho kết quả như sau:
- EHP ở 53.84% mẫu, so với chỉ 42.31% bằng qPCR.
- AHPND được phát hiện với tỷ lệ 23.08% (tương đương qPCR).
Như vậy, ddPCR cho kết quả ổn định, chính xác, đặc biệt trong các mẫu có tải lượng mầm bệnh thấp điều mà qPCR thường khó đạt được.
3. Tiềm năng phát triển của Công nghệ vi giọt ddPCR kép trong thuỷ sản
Tôm bị nhiễm EHP (has become a major concern for the shrimp farming industry) có nguy cơ cao bị nhiễm thêm VPAHPND cũng như SHPN gây bệnh hoại tử gan tụy nhiễm trùng. Cơ chế gây bệnh của hai tác nhân này khác nhau: EHP tiêu thụ chất dinh dưỡng trong bào tương từ đó làm tế bào vỡ và chết, trong khi VPAHPND phá hủy các protein khung tế bào. Nhìn chung, cả hai bệnh đều dẫn đến bong tróc tế bào biểu mô gây tổn thương nghiêm trọng gan tụy và có thể dẫn đến tôm tử vong.
Một số nghiên cứu cho thấy, tôm nhiễm EHP có khả năng nhiễm Vibrio cao hơn dễ dẫn đến nhiễm trùng hỗn hợp làm bệnh trở nên nghiêm trọng hơn. Do đó, việc phát triển phương pháp phát hiện nhanh và chính xác để đồng thời phát hiện nhiều mầm bệnh trên tôm là rất cần thiết.
Trong bối cảnh đó, phương pháp ddPCR (digital droplet PCR) được đánh giá là có nhiều ưu điểm vượt trội:
- Không cần đường chuẩn để định lượng, giúp đơn giản hóa quy trình.
- Ít bị ảnh hưởng bởi chất ức chế so với qPCR nên cho kết quả ổn định hơn.
- Phù hợp để kiểm tra nhiều mẫu khác nhau như tôm giống, nước, bùn, thức ăn trong suốt quá trình nuôi.
Tuy nhiên, ddPCR yêu cầu chi phí thiết bị và vật tư cao, đòi hỏi cần có cải tiến để mở rộng ứng dụng trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản.
4. Tài liệu thao khảo
Zhang, H., Gong, H. Y., Cao, W. W., Que, M. Y., Ye, L., & Shi, L. (2022). Duplex droplet digital PCR method for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei and Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease. Journal of fish diseases, 45(6), 761–769. https://doi.org/10.1111/jfd.13600
