ABT® Urine Prep Solution (HI-010)

Tổng quan 

Trước đây, đường tiết niệu được xem là một môi trường vô trùng, không kể khi bị viêm đường tiết niệu. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây áp dụng phương pháp nuôi cấy và sinh học phân tử chứng minh rằng nước tiểu vẫn chứa một lượng tương đối nhỏ vi khuẩn (ít hơn 10⁵ CFU/mL nước tiểu), thấp hơn nhiều so với trung bình 10¹² CFU/mL ở các vị trí khác trên cơ thể như đường ruột, âm đạo,… Dù vậy, nước tiểu vẫn là một nguồn mẫu không xâm lấn khá tin cậy thường được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn hoặc kí sinh trùng lây lan qua đường tình dục như Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium và Trichomonas vaginalis thông qua phương pháp khuếch đại axit nucleic. Ngoài ra, đánh giá hệ vi sinh vật hiện diện ở đường tiết niệu còn góp vai trò quan trọng trong tầm soát lâm sàng mà hiện vẫn đang được nghiên cứu rộng rãi, như là viêm niệu đạo, nhiễm trùng đường tiết niệu, ung thư bàng quang,… Thêm vào đó, việc thu thập nước tiểu được nam giới chấp nhận hơn so với quét tăm bông niệu đạo. Tuy nhiên, các phương pháp tối ưu để xử lý mẫu nước tiểu cho các nghiên cứu dựa trên PCR chưa được nghiên cứu rộng rãi.

Nhằm giải quyết vấn đề nồng độ vi khuẩn thấp hiện diện trong nước tiểu, việc tăng thể tích nước tiểu (>30mL) là một cách tiếp cận nhằm tăng năng suất thu hồi DNA thường được áp dụng. Tuy nhiên, trong nước tiểu thường chứa nồng độ cao các chất ức chế PCR như urê, β HCG, và các tinh thể muối gây cản trở đến việc phát hiện DNA vi khuẩn. Nước tiểu thường được làm lạnh hoặc đông lạnh để ngăn chặn sự phát triển quá mức của vi khuẩn và ngăn chặn sự thoái hóa của axit nucleic. Tuy nhiên, việc để nước tiểu ở nhiệt độ thấp có thể dẫn đến kết tủa một số loại tinh thể như canxi oxalat, axit uric và tinh thể phốt phát vô định hình hoặc urate, điều này có thể làm giảm năng suất DNA và gây ức chế trong các ứng dụng sinh học phân tử. Khi ly tâm lượng lớn nước tiểu có thể làm trầm trọng thêm việc cản trở quá trình tách chiết DNA và phản ứng PCR. Đun nóng nước tiểu để hoà tan các loại tinh thể này là một trong những cách tiếp cận vấn đề, nhưng như vậy cũng dễ dẫn đến sự ly giải màng tế bào vi khuẩn, gây thoái hoá DNA hoặc khiến vi khuẩn tăng sinh không kiểm soát. Ngoài nhiệt độ, độ pH cũng là một yếu tố liên quan đến sự hình thành các tinh thể trong nước tiểu. Ví dụ như các tinh thể axit uric và tinh thể urate vô định hình có xu hướng hình thành trong nước tiểu có tính axit (thường là pH <5.8), canxi photphat và tinh thể phốt phát vô định hình trong nước tiểu trung tính hoặc kiềm. Hoặc có những loại không phụ thuộc vào độ pH như tinh thể canxi oxalat có thể hình thành với lượng cần thiết nồng độ Ca²⁺ trong nước tiểu.

Sản phẩm ABT ® Urine Prep Solution cung cấp dung dịch xử lý nước tiểu gồm các thành phần giúp hoà tan tinh thể muối, ổn định lượng DNA và vi sinh vật hiện diện trong nước tiểu. Nhờ đó giúp tăng hiệu quả tách chiết DNA, cải thiện khả năng phát hiện mục tiêu trong phản ứng PCR so với khi nước tiểu không được xử lý.

ABT ® Urine Prep Solution

Mục đích sử dụng: Xử lý mẫu nước tiểu để loại bỏ muối và tạp chất cho mục đích ly trích DNA/RNA.

Thông số kỹ thuật:

• Thể tích nước tiểu tối đa có thể xử lý trong 1 test: 45mL (khuyến nghị 40 mL trong HDSD), không bao gồm 5mL dung dịch xử lý.
• Nồng độ % (v/v) tối thiểu cần thiết của dung dịch xử lý: 10% (v/v).
• Độ pH của nước tiểu sau xử lý: 6-8.
• Hiệu quả thu hồi DNA vi khuẩn: sớm hơn mẫu không xử lý 2-8 Ct.
• Độ tinh sạch A260/A280: 130-200% so với mẫu không xử lý.
• Hạn sử dụng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất.
• Điều kiện bảo quản: Nhiệt độ phòng.

Quy cách đóng gói:

Quy trình thực hiện

I. XỬ LÝ NƯỚC TIỂU TRƯỚC KHI BẢO QUẢN (Cách 1)

1. Thu thập và xử lý mẫu nước tiểu

– Tiến hành thu nước tiểu vào các các lọ chứa mẫu với thể tích nằm trong khoảng 5-40mL.

– Bổ sung 5mL dung dịch xử lý vào lọ chứa.

– Vặn kín nắp và bảo quản ở nhiệt độ mát 2-8℃ cho đến khi tách chiết.

2. Thu thập mục tiêu tách chiết trong nước tiểu

– Chuyển tối đa 40mL nước tiểu đã được xử lý vào ống ly tâm.

Chú ý:

• Sử dụng tube 1.5mL nếu xử lý ≤ 1mL nước tiểu.
• Sử dụng ống falcon 15mL nếu xử lý > 1mL đến 14mL nước tiểu.
• Sử dụng ống falcon 50mL nếu xử lý > 14mL đến 40mL nước tiểu.

– Ly tâm thu sinh khối.

Chú ý: có thể áp dụng lực ly tâm khác nhau tuỳ theo đối tượng muốn chiết xuất DNA để có hiệu quả tốt nhất và phù hợp với điều kiện phòng lab.

+ Vi khuẩn, nấm: ≥ 4000×g, 10 phút.

    + cfDNA: (đến phần Thông Tin Bổ Sung-1).

    + Virus: (đến phần Thông Tin Bổ Sung-2).

– Tách chiết theo hướng dẫn sử dụng của các bộ kit tách chiết. Hoặc bảo quản ở -20^oC nếu chưa tách chiết ngay.

1. XỬ LÝ NƯỚC TIỂU SAU KHI BẢO QUẢN (Cách 2)
2. Thu thập mẫu nước tiểu

– Tiến hành thu nước tiểu vào các các lọ chứa mẫu với thể tích nằm trong khoảng 5-40mL.

– Vặn kín nắp và bảo quản ở nhiệt độ mát 2-8℃ cho đến khi tách chiết.

2. xử lý mẫu nước tiểu

– Bổ sung 5 mL dung dịch xử lý vào lọ chứa mẫu.

– Lắc đều lọ chứa mẫu và đợi trong 3 phút cho tinh thể được hoà tan.

– Nước tiểu trở nên trong suốt (hoặc còn ít cặn bụi không đáng kể). Nếu mẫu nước tiểu có quá nhiều tinh thể, có thể tiếp tục thêm 1-5mL dung dịch xử lý.

3. Thu thập mục tiêu tách chiết trong nước tiểu (Tương tự mục I.2.)

LƯU Ý:

– Nước tiểu sau khi được xử lý với ABT ® Urine Prep Solution có thể không thích hợp cho các thử nghiệm sinh hoá khác ngoài tách chiết DNA và phản ứng PCR.

– Nước tiểu có thể được xử lý với thể tích <5mL, miễn sao thể tích dung dịch xử lý thêm vào đạt từ 10–40% (v/v) tổng thể tích cuối cùng. Ví dụ, bổ sung 100µL dung dịch xử lý vào 900µL nước tiểu. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật diện hiện trong nước tiểu thường ở mật độ thấp, nên nếu thể tích đầu vào quá thấp có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện mục tiêu PCR.

– Dung dịch nước tiểu sau khi được xử lý có thể còn một lượng nhỏ cặn, bụi trôi nổi, tạp chất hữu cơ,…

THÔNG TIN BỔ SUNG:

1. Đối với mục tiêu tách chiết là “cfDNA” có thể thực hiện xử lý như sau:

+ Ly tâm tối đa 5mL/ống nước tiểu đã được xử lý với ABT ® Urine Prep Solution ở tốc độ 16000×g trong 10 phút ở 4℃.

+ Cẩn thận chuyển phần nổi phía trên (4-4.5mL) sang một ống mới mà không làm tủa sau ly tâm bị xáo trộn. Khi này, dịch nổi phía trên chứa cfDNA trôi nổi bên trong.

+ Tiến hành tách chiết cfDNA từ dịch nổi đã thu theo hướng dẫn tiếp theo của bộ kit tách chiết (mẫu có thể được bảo quản tạm thời ở -80℃ cho đến khi sẵn sàng tách chiết).

2. Đối với mục tiêu tách chiết là “virus” có thể thực hiện xử lý như sau:

+ Ly tâm tối thiểu 20mL nước tiểu đã được xử lý với ABT ® Urine Prep Solution ở tốc độ 4000×g trong 10 phút.

+ Sau đó, hoà tan lại tủa sau ly tâm trong 5mL bằng chính dịch nổi phía trên.

+ Tiến hành tách chiết DNA/RNA virus theo hướng dẫn tiếp theo của bộ kit tách chiết (mẫu có thể được bảo quản tạm thời ở -80℃ cho đến khi sẵn sàng tách chiết).

Quy trình trên chỉ mang tính tham khảo đối với tách chiết cfDNA và virus, người sử dụng nên tham khảo từ các nguồn khác nhau hoặc tuân thủ theo hướng dẫn cụ thể của các bộ kit tách chiết cfDNA và virus.

Tham khảo thêm: Hóa chất ABT ; Video HDSD kit ABT