Real-time PCR là gì?
Real-time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng theo thời gian thực (qPCR), được phát triển vào năm 1993 để phát hiện và định lượng axit nucleic. Công nghệ này được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu y sinh, nông nghiệp, thực phẩm và khoa học môi trường. Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán mới được phát triển trong những năm gần đây như phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt, phương pháp đẳng nhiệt trung gian vòng lặp (LAMP), khuếch đại vòng tròn lăn (RCA), khuếch đại axit nucleic đẳng nhiệt bằng Recombinase Polymerase Amplification (RPA) và kỹ thuật chẩn đoán dựa trên CRISPR có độ nhạy cao (SHERLOCK). qPCR vẫn được coi là công nghệ mạnh mẽ nhất trong xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng, đặc biệt đối với các bệnh truyền nhiễm.
Về mặt định nghĩa, kỹ thuật Real-time PCR được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR. Real-time PCR sử dụng các phân tử phát huỳnh quang có khả năng liên kết với gene mục tiêu, từ đó cho phép theo dõi trực tiếp số lượng bản sao DNA mục tiêu tạo ra ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng bằng công nghệ huỳnh quang. Như vậy, cường độ tín hiệu huỳnh quang máy ghi nhận sẽ phản ánh trực tiếp lượng DNA khuếch đại giúp người làm thí nghiệm có thể quan sát tại các thời điểm cụ thể.
Dựa trên chất phát huỳnh quang sử dụng và tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện, Real-time PCR có thể sử dụng (1) các phân tử huỳnh quang gắn chèn vào DNA sợi đôi (SYBR Green hoặc SYTO9) và (2) các phân tử đầu dò đánh dấu huỳnh quang gồm đầu dò thủy phân (thường là TaqMan probes) hoặc đầu dò lai và phân tử beacons. Trong đó, các đầu dò TaqMan được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng axit nucleic và thường được phát triển thành bộ kit thương mại để chẩn đoán lâm sàng.
Cơ chế huỳnh quang của đầu dò Taqman (Taqman Probe)
Đầu dò TaqMan là một loại đầu dò đánh dấu huỳnh quang phổ biến sử dụng trong Real-time PCR để phát hiện và định lượng một hoặc nhiều tác nhân mục tiêu có trong mẫu.
Cấu tạo của đầu dò Taqman là đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 25-30 nu có khả năng liên kết bổ sung với gene mục tiêu ở giữa 2 mồi xuôi và ngược. Đầu 5’ của đầu dò được đánh dấu bằng một chất phát huỳnh quang (donor hay reporter) và đầu 3’ được đánh dấu bằng một chất hấp thụ (acceptor hay quencher). Nếu một chất phát huỳnh quang hấp thụ năng lượng ánh sáng ở bước sóng kích thích (Hình 2). Theo nguyên tắc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET), chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ nằm gần nhau và năng lượng kích thích từ chất phát huỳnh quang sẽ bị dập tắt bị bởi chất hấp thụ, do đó không có tín hiệu huỳnh quang phát ra.
Khi có sự hiện diện của trình tự gene mục tiêu, enzyme polymerase kéo dài mồi trên mạch khuôn, bổ sung nucleotide tạo một chuỗi DNA bổ sung. Khi tới vị trí đầu dò, polymerase không thể kéo dài đầu dò vì nó không chứa nhóm OH tự do. Lúc này Taqman sẽ bị thủy phân bởi hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Polymerase trong phản ứng luân nhiệt. Chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ được giải phóng khỏi chất hấp thụ, chất hấp thụ không còn khả năng hấp thụ tín hiệu huỳnh quang phát ra do đó sẽ phát tín hiệu huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích. Hệ thống ghi nhận cường độ huỳnh quang tăng sau mỗi chu kỳ tỷ lệ thuận với lượng DNA khuếch đại được tạo ra.
Quá trình thủy phân đầu dò cũng giúp loại bỏ đầu dò khỏi gene mục tiêu, cho phép tiếp tục kéo dài mồi để tổng hợp đến cuối sợi DNA khuôn. Do đó, việc đưa đầu dò vào không gây cản trở quá trình khuếch đại.
Trong thực tế, khả năng dập tắt tín hiệu của chất hấp thụ không hoàn toàn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Hơn nữa, số lượng DNA đích nhân lên trong giai đoạn đầu chưa đủ để chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích và phát ra ánh sáng huỳnh quang để máy thu nhận. Do đó, giai đoạn ủ thường tạo ra tín hiệu nền (baseline) trong phản ứng Real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman.
Bảng 1. Thông tin về chất phát huỳnh quang – chất hấp thụ phù hợp với bước sóng cụ thể.
Để chọn lựa huỳnh quang cho đầu dò Taqman, các chất phát huỳnh quang (Reporter) được lựa chọn phụ thuộc vào độ dài sóng của nguồn sáng kích thích, kênh màu trên thiết bị Real-time đang sử dụng và các chất hấp thụ tương ứng. Các chất hấp thụ (Quencher) trong đầu dò Taqman gồm 2 loại chất hấp thụ phát huỳnh quang (TAMRA) và chất hấp thụ phát nhiệt (DABCYL, BHQ1, BHQ2, BBQ). Trong đó, nhóm chất hấp thụ phát nhiệt thường được sử dụng vì khả năng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh không cho bất cứ huỳnh quang nào phát ra được từ chất phát huỳnh quang. Đồng thời dễ dàng để thiết kế đầu dò taqman cho phản ứng Multiplex mà không lo sự trùng lắp phổ huỳnh quang giữa chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ.
Vì sao lại sử dụng đầu dò TaqMan trong bộ kit ABT?
Việc phát hiện và định lượng mầm bệnh đòi hỏi độ nhạy, độ đặc hiệu và độ tái lập cao. Thông thường, các chất huỳnh quang gắn chèn (SYBR Green) là những phân tử nhỏ nằm xen kẽ các sợi DNA mạch đôi mới hình thành, dẫn đến việc tăng cường tín hiệu huỳnh quang. Ưu điểm chất huỳnh quang gắn chèn là chi phí rẻ, không cần thiết kế có thể theo dõi quá trình khuếch đại của sợi DNA mạch đôi mà không cần đầu dò, điều này giúp giảm thiểu chi phí thiết lập và vận hành thí nghiệm. Tuy nhiên, bất kỳ sản phẩm không đặc hiệu nào như Primer-dimer tạo ra trong phản ứng đều có thể liên kết với thuốc nhuộm dẫn đến kết quả dương tính giả và định lượng không chính xác. Vì vậy chất huỳnh quang gắn chèn có nhiều hạn chế trong qPCR để xác định chất lượng biểu hiện gene và chẩn đoán phân tử.
Hệ thống Real-time PCR được cải thiện bằng cách sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang Taqman probe. Đầu dò có thể được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau cho phép khuếch đại đặc hiệu các sản phẩm khuếch đại trong phản ứng. Điều này làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu giữa đầu dò và mục tiêu để tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Do đó, đầu dò TaqMan đã được sử dụng để phát triển phương pháp Real-time PCR đơn kênh và đa kênh nhằm phát hiện một hoặc nhiều tác nhân gây bệnh cùng lúc trong mẫu. Ngoài ra, đầu dò Taqman ứng dụng trong các thử nghiệm liên quan đến biểu hiện gene, định lượng DNA, Chip, Xác định kiểu gene SNP, Phân tích con đường microRNA và RNA nhỏ, phát hiện đột biến và phân tích protein.
ABT sử dụng đầu dò Taqman trong phát triển các bộ kit Real-time PCR nhằm chẩn đoán bệnh ở người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm và GMO. Các chất phát quang thường được sử dụng bao gồm kênh FAM, HEX, Texas Red, và Cy5. Đây là các chất có bước sóng huỳnh quang tối đa cách xa nhau nhất và phù hợp với nguồn sáng kích thích và huỳnh quang phát ra từ máy Real-time PCR. Tổng thời gian thực hiện trung bình là 1 giờ 30 phút. Các bộ kit TaqMan qPCR được thiết kế đặc hiệu với trình tự mục tiêu, sử dụng hoạt tính nuclease 5′ của Taq Polymerase và đầu dò Taqman để tăng độ đặc hiệu cho việc phát hiện DNA mục tiêu. Điều này mang lại kết quả chính xác, độ nhạy cao, dễ sử dụng và hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm.
Tài liệu tham khảo
[1] Artika, I. M., Dewi, Y. P., Nainggolan, I. M., Siregar, J. E., & Antonjaya, U. (2022). Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes, 13(12), 2387. https://doi.org/10.3390/genes13122387
[2] Zhang, M., Liu, K., Hu, Y. et al. A novel quantitative PCR mediated by high-fidelity DNA polymerase. Sci Rep 7, 10365 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-10782-4
[3] ThermoFisher Sciencetific. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. ThermoFisher Sciencetific. https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/taqman-vs-sybr-chemistry-real-time -pcr.
[4] GeneLink. Fluorescent Dyes Applications. https://www.genelink.com/oligo_modifications_reference/OMR_mod_category_applications.asp?mod_sp_cat_id=18
[5] CÔNG TY TNHH GIẢI PHÁP Y SINH ABT. (2023). Tổng Hợp Kiến Thức Chi Tiết Về Kỹ Thuật Real-Time PCR. https://abtvn.com/real-time-pcr/
