Tách chiết nucleic acid là phương pháp cơ bản trong xét nghiệm sinh học phân tử. Hiện nay, nhiều phương pháp tách chiết thu nhận nucleic acid tinh sạch đã được phát triển thành các bộ kit thương mại. Trong số đó, tách chiết bằng cột silica là phương pháp phổ biến dựa trên sự tương tác giữa nucleic acid và chất hấp thụ rắn (thường là hạt silica) trong các điều kiện cụ thể.
Tách chiết cột silica
Silica, hay dioxide silic (SiO2), là một dạng silica xốp có cấu trúc vô định hình. Silica bao gồm một mạng lưới các hạt có kích thước từ 2-20 nm kết nối với nhau tạo thành chất hấp thụ rắn có ái lực liên kết mạnh và đặc hiệu với nucleic acid trong điều kiện kiềm và muối cao. Nguyên lý của tách chiết cột silica dựa trên ái lực giữa nucleic acid tích điện âm và bề mặt hạt silica tích điện dương trong điều kiện nồng độ muối chaotropic cao, giúp gắn nucleic acid lên cột. Trong khi đó, các thành phần tế bào và hóa chất khác không bám lên cột sẽ bị rửa trôi. Cuối cùng, DNA được rửa giải khỏi màng silica bằng nước hoặc dung dịch đệm có hàm lượng muối thấp. Quy trình thực hiện tách chiết nucleic acid bằng cột silica bao gồm các bước: ly giải tế bào, gắn cột, rửa cột, làm khô cột và rửa giải.
Trong phương pháp tách cột silica, cột quay (spin-column) là thành phần quan trọng để hỗ trợ cho quá trình tách chiết thủ công. Cột thường được làm bằng chất liệu nhựa đặc biệt (thường là polypropylene dùng trong y tế), cột ly tâm có kích thước nhỏ hơn so với ống thu mẫu với lỗ hẹp dưới đáy để có thể lắp vừa khít với ống thu. Ngay phía trên lỗ hẹp là lớp màng silica gel có điện tích dương giúp gắn và liên kết nucleic acid tích điện âm với chất nền.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh cơ chế liên kết của axit nucleic trên bề mặt silica chịu sự tác động của bốn yếu tố chính gồm: liên kết hydro, cầu muối, lực tĩnh điện hình thành giữa axit nucleic và bề mặt silica và độ hòa tan của axit nucleic. Do đó, liên kết axit nucleic được tối ưu hóa với các dung dịch đệm đặc trưng ở nồng độ muối và pH chính xác với loại mẫu cần tách chiết.
Mỗi loại tế bào mục tiêu thường được đặc trưng bởi cấu tạo lớp màng và thành phần vách tế bào khác nhau nên sẽ phù hợp với các loại hóa chất ly giải khác nhau. Ví dụ, để tách chiết mẫu mô, sinh thiết và dịch phết y tế chẩn đoán ung thư cổ tử cung (HPV), ABT sử dụng dung dịch đệm đặc trưng là TL buffer và CL buffer. Trường hợp chẩn đoán Viêm gan B và Viêm gan C , ABT sử dụng dung dịch đệm NL buffer và RL buffer tách chiết mẫu huyết thanh/huyết tương. Như vậy, mỗi loại nền mẫu có thể tối ưu với loại buffer ly giải và quy trình xử lý khác nhau. Đối với các loại nền mẫu mới, người sử dụng cần đánh giá để lựa chọn bộ kit ly trích hiệu quả nhất cho loại nền mẫu mà mình cần ly trích.
Các bước thực hiện tách chiết cột silica của ABT trên nền mẫu thú y
Kit tách cột silica do ABT sản xuất ứng dụng trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh trong đa dạng lĩnh vực khác nhau. Chi tiết các bước thực hiện tách chiết cột silica trên nền mẫu thú y nhằm chẩn đoán một số bệnh trên heo, chó, mèo… được trình bày như ở quy trình sau:
Ly giải tế bào: Mẫu thú y bao gồm mẫu tế bào nuôi cấy, vi khuẩn, huyễn dịch, mẫu quét bề mặt, mẫu dịch phết (y tế), dịch phết (họng/mũi), huyết thanh, huyết tương và mẫu máu toàn phần từ người và động vật có vú được ly giải nhờ dung dịch đệm VBL Buffer. Trong dung dịch đệm ly giải thường chứa các chất có khả năng ly giải mẫu như Triton X100, SDS, Tween 20 và muối chaotropic nồng độ cao giúp hỗ trợ hòa tan protein. Sau đó bổ sung proteinase K và ủ ở 72°C nhằm hỗ trợ phá vỡ các protein màng, giải phóng nucleic acid ra khỏi tế bào và mô.
Gắn cột: Hỗn hợp sau ly giải sẽ được chuyển lên cột silica. Lúc này, muối chaotropic nồng độ cao cung cấp điện tích dương làm cầu nối để DNA bám lên màng silica, ethanol cạnh tranh nước với nucleic acid giúp hỗ trợ cho việc gắn acid nucleic lên màng silica. Các thành phần tạp nhiễm khác được loại bỏ thông qua bước ly tâm. Trong quá trình này, ethanol nồng độ cao thường được bổ sung giúp tăng cường quá trình gắn nucleic acid lên cột do ảnh hưởng đến sự liên kết của nucleic acid với silica.
* Note: Ethanol ảnh hưởng đến khả năng liên kết với nucleic acid. Do đó, lượng ethanol bổ sung được ABT tối ưu hóa cho từng bộ kit tách chiết sử dụng. Nếu sử dụng quá nhiều ethanol sẽ ảnh hưởng đến chất lượng axit nucleic thu nhận dẫn đến DNA/RNA dễ bị phân hủy ảnh hưởng đến kết quả A260/A280 và hiệu suất thu hồi. Quá ít Ethanol sẽ khó rửa sạch hết muối khỏi màng.
Loại bỏ tạp chất: Dung dịch WB1 chứa muối chaotropic nồng độ thấp để rửa protein và sắc tố. Dung dịch WB2 chứa ethanol nồng độ cao để loại muối chaotropic và các thành phần còn sót lại. Việc loại bỏ muối chaotropic là rất quan trọng giúp nâng cao hiệu suất thu hồi và chất lượng nucleic acid.
Thu nhận nucleic acid: Sau bước rửa hai lần, hầu hết các quy trình đều có một bước ly tâm để làm làm khô cột. Việc này giúp loại bỏ ethanol và là cần thiết để có dung dịch rửa giải sạch. Sau đó, dung dịch ly giải EB (nước xử lý DEPC cho RNA hoặc dung dịch TE có pH>9) giúp giải phóng các DNA/RNA sạch khỏi màng silica. Nucleic acid tinh sạch được bảo quản ở -20°C phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Các lưu ý an toàn phòng thí nghiệm
Tách chiết silica là một phương pháp quan trọng trong việc thu nhận nucleic acid tinh sạch. Phương pháp này có ưu điểm tách chiết nhanh chóng, đơn giản thu nhận nucleic acid tinh sạch cao. Ngoài ra, bộ kit có ưu điểm không sử dụng hóa chất độc hại như phenol, chloroform. Tuy nhiên để sử dụng bộ kit người sử dụng cần trang bị các thiết bị hỗ trợ như máy ly tâm, vortex và tuân thủ đúng quy trình để đảm bảo kết quả tách chiết chính xác:
Các mẫu xét nghiệm phải được xử lý theo đúng quy trình đề phòng phát tán vi khuẩn/virus ra ngoài môi trường. Kit phải được thao tác trong tủ thao tác PCR hoặc tủ ATSH và luôn luôn mặc áo Blouse, sử dụng găng tay, khẩu trang.
Ngoài ra, cần sử dụng hóa chất đúng cách, tránh tiếp xúc trực tiếp, và làm việc trong khu vực thông gió tốt. Khi phát hiện sự cố như rò rỉ hóa chất, cần xử lý ngay theo quy trình an toàn của phòng thí nghiệm.
Tài liệu tham khảo
- Ali, Nasir; Rampazzo, Rita de Cássia Pontello; Costa, Alexandre Dias Tavares; Krieger, Marco Aurelio (2017). Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International, 2017(), 1–13. doi:10.1155/2017/9306564
- Hu, WP., Chen, YC. & Chen, WY. Improve sample preparation process for miRNA isolation from the culture cells by using silica fiber membrane. Sci Rep 10, 21132 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78202-8
- Sahu, O., & Singh, N.K. (2019). Significance of bioadsorption process on textile industry wastewater. The Impact and Prospects of Green Chemistry for Textile Technology. Lee, H., Na, W., Park, C. et al. Centrifugation-free extraction of circulating nucleic acids using immiscible liquid under vacuum pressure. Sci Rep 8, 5467 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-23766-9
