Một quy trình chẩn đoán phân tử hoàn chỉnh sẽ bao gồm thu mẫu, xử lý mẫu, tách chiết nucleic acid, phân tích phân tử và đánh giá, diễn giải kết quả. Trong đó, bước tách chiết sẽ phân lập và làm sạch phân tử nucleic acid mục tiêu. Đây được coi là bước không thể thiếu trong xét nghiệm sinh học phân tử.
Nucleic acid sau khi được ly trích sẽ trở thành nguồn nguyên liệu đầu vào và quyết định chất lượng kết quả cho các thí nghiệm tiếp theo sau đó như PCR, giải trình tự, Western blotting hay microarray. Tùy theo loại mẫu, mục đích và yêu cầu đối với nucleic acid sau ly trích, có thể có nhiều phương pháp ly trích khác nhau. Hiện nay, có nhiều phương pháp tách chiết như dùng phenol-chloroform, cột silica, hạt từ tính, …
Trong đó, hạt từ được coi là nguyên liệu hiệu quả trong phát triển các phương pháp tách chiết từ thủ công đến tự động. Với mỗi phương pháp tách chiết dù là thủ công hay tự động đều sẽ có ưu nhược điểm riêng. Do vậy, việc lựa chọn phương pháp tách hạt từ phụ thuộc vào yêu cầu cụ thể của ứng dụng, điều kiện thí nghiệm, khả năng của kỹ thuật viên và mức độ tự động hóa mong muốn. Tuy nhiên, cả hai phương pháp đều đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất và hiệu quả của các xét nghiệm sinh học phân tử.
1. Tính năng của hạt từ tính
Hiện nay, công nghệ nano đang ngày càng phát triển và đạt được nhiều thành tựu to lớn không chỉ trong lĩnh vực nghiên cứu mà còn mở rộng phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong đó, hạt nano oxit sắt từ được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khoa học kỹ thuật, xử lý môi trường và đặc biệt là lĩnh vực y sinh. Hai loại hạt oxit sắt phổ biến được sử dụng là maghemite (γ -Fe2O3) và magnetite (Fe3O4), với kích thước chỉ khoảng 20 đến 30 nm. Chúng là các vật liệu nano nổi bật với các tính chất như tính siêu thuận từ, tính tương thích sinh học, tính ổn định, thuộc tính hóa lý và các thuộc tính có liên quan khác. Các hạt này được bọc một lớp chất hoạt động bề mặt, cho phép chúng phân tán trong một dung môi đồng nhất được gọi là chất lỏng từ. Các hiệu ứng lượng tử từ việc giảm kích thước và diện tích bề mặt lớn của các hạt nano đã thay đổi một số đặc tính từ đặc trưng của vật liệu, làm nổi bật hiện tượng siêu thuận từ.
Đặc tính này giúp các hạt siêu thuận từ chỉ thể hiện tính từ khi có từ trường bên ngoài và làm nổi bật sự khác biệt so với các loại sắt từ phổ biến khác. Điều này giúp hạn chế tối đa sự kết tụ không mong muốn khi ở ngoài lực từ trường. Ngoài ra, kích thước nhỏ cho phép các hạt này trở nên tách biệt khi ở dạng huyền phù trong dung dịch.
Về cấu trúc, phần lõi của các hạt từ là oxit sắt và được bao phủ bởi các lớp vỏ chức năng khác nhau, tạo ra các đặc tính liên kết đặc biệt cho hạt từ. Bề mặt của các hạt này được điều chỉnh thông qua việc bọc một vài lớp nguyên tử của các polime hữu cơ, kim loại (Au), các oxit vô cơ (như SiO2, Al2O3) và cũng có thể chức hóa bằng cách gắn các phân tử có hoạt tính sinh học khác nhau. Bên cạnh đó, lớp vỏ giúp tránh sự kết tụ, giảm sự lắng đọng, hạn chế sự oxy hóa của hạt nano cũng như tạo cho bề mặt của chúng có những đặc thù khác biệt để phù hợp với từng ứng dụng khác nhau.
Dựa trên các đặc tính đó các hạt nano siêu thuận từ mở ra tiềm năng lớn cho những ứng dụng trong lĩnh vực y sinh, bao gồm tinh sạch các phân tử sinh học, tăng độ tương phản trong máy cộng hưởng từ hạt nhân, phân tách và chọn lọc tế bào, hiệu ứng nhiệt và phân phát thuốc. Trong đó, hạt từ tính phủ silica đã được ứng dụng một cách hiệu quả trong việc ly trích và tinh sạch nucleic acid từ các mẫu thô và từ nhiều loại mẫu khác nhau.
2. Nguyên tắc phương pháp tách chiết nucleic acid bằng hạt từ tính
Trong tách chiết nucleic acid, hạt từ tính với lõi oxit sắt được bao phủ bề mặt với silica là vật liệu phù hợp để gắn DNA/RNA. Silica với đặc tính không độc hại có khả năng tạo polymer liên kết ngang rộng rãi, hình thành một lớp vỏ bảo vệ trơ bên ngoài các hạt nano và chúng rất tương thích sinh học bởi silica thường được kết thúc bằng một nhóm silanol có thể phản ứng với các tác nhân khác nhau để gắn cộng hóa trị các phối tử cụ thể vào bề mặt của các hạt nano từ tính này.
Hạt từ phủ silica có ưu điểm là xốp, diện tích bề mặt riêng lớn, không độc và khá trơ về mặt hóa học, vì vậy silica có khả năng hấp phụ và khả năng ứng dụng cao. So với các hạt nano khác, hạt từ phủ silica có ưu điểm là dễ phân tán hơn trong các polymer. Với những tính chất đặc trưng đó của hạt từ phủ silica đã được ứng dụng hiệu quả trong tách chiết nucleic acid.
Quy trình tách chiết nucleic acid bằng hạt từ tính bao gồm 4 bước chính: (1) ly giải tế bào, (2) cố định nucleic acid lên bề mặt hạt từ, (3) loại bỏ tạp chất, (4) thu nhận nucleic acid
(1) Ly giải tế bào: Mẫu được ly giải để phá vỡ màng tế bào và giải phóng nucleic acid bằng các chất phá màng như Triton X-100, SDS, Tween 20, proteinase K, …
(2) Cố định nucleic acid lên bề mặt hạt từ: Muối trao đổi ion ở nồng độ cao hay còn gọi là muối chaotropic (guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, urea,…) và ethanol được sử dụng để làm tăng tính kỵ nước của nucleic acid. Lúc này trong dung dịch hình thành các cầu nối cation giữa DNA/RNA và bề mặt silica của hạt từ (Hình 2). Thời gian hút/nhả hạt từ cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết
(3) Loại bỏ tạp chất: Các thành phần như protein, lipid và các tạp chất khác sẽ được loại bỏ bằng các dung dịch rửa. Trong quá trình rửa vẫn phải đảm bảo sự gắn chặt của nucleic acid vào màng silica nên trong các dung dịch rửa thường bổ sung ethanol.
(4) Thu nhận nucleic acid: Bước này nucleic acid được vào dung dịch đệm để phá vỡ liên kết với màng silica. Theo đó, nước xử lý DEPC cho RNA hoặc dung dịch TE có pH 8-9 để thu nhận và bảo quản DNA.
Như vậy, cơ chế của phương pháp tách chiết nucleic acid bằng hạt từ phủ silica dựa trên sự tương tác giữa nucleic acid và silica ở điều kiện pH và nồng độ muối cao. Hạt từ phủ silica có thể được điều chỉnh kích thước và hóa tính bề mặt, tạo điều kiện thuận lợi cho tách chiết nucleic acid trên nhiều loại nền mẫu khác nhau. Trước đây, phương pháp này cũng được tiến hành thủ công hoàn toàn như các phương pháp truyền thống khác, ưu điểm lớn của tách chiết hạt từ thủ công là dễ dàng thực hiện, dụng cụ thí nghiệm đơn giản, ít độc hại, không yêu cầu máy ly tâm trợ lực và có thể thực hiện ngoài thực địa.
Sau này với sự phát triển của công nghệ tự động hóa, hạt từ phủ silica được ứng dụng vào các thiết bị trong quá trình tách chiết nucleic acid giúp gia tăng hiệu suất và độ chính xác cao hơn, đồng thời giảm thiểu sự can thiệp của con người. Dù là hình thức thực hiện thủ công hay tự động, phương pháp tách chiết nucleic acid bằng hạt từ đang được ứng dụng rộng rãi trong thí nghiệm về sinh học phân tử.
3. Phương pháp tách chiết hạt từ thủ công
Quá trình thực hiện tách chiết nucleic acid bằng hạt từ theo dạng thủ công được thực hiện hoàn toàn bằng tay, từ chuẩn bị mẫu đến thu nhận nucleic acid. Hình 3 mô tả quá trình thực hiện tách chiết nucleic acid thủ công bằng hạt từ tính. Đầu tiên, mẫu được hòa trộn với dung dịch ly giải để giải phóng nucleic acid ra khỏi tế bào. Tiếp theo, hạt từ sẽ được cho vào tube mẫu đã ly giải, DNA/RNA lúc này sẽ gắn kết lên bề mặt hạt từ với sự có mặt của muối và ethanol. Sau đó, các tube dung dịch sẽ được gắn vào chân đế nam châm (magnetic stand), lúc này các hạt từ gắn DNA/RNA sẽ được cô lập ra thành cụm trên thành tube do từ trường tác động bên ngoài.
Dung dịch chứa các tạp chất sẽ được hút bỏ ra bên ngoài. Ở bước tiếp theo, các dung dịch rửa được cho vào tube để loại bỏ tạp chất, khối hạt từ – nucleic acid lần lượt được thả và hút lại bằng cách gắn vào chân đế nam châm. Cuối cùng dung dịch đệm được cho vào giúp giải phóng liên kết giữa hạt từ và nucleic acid, DNA/RNA được thu nhận vào tube mới, hạt từ được gom lại và loại bỏ.
Nhìn chung, quy trình thủ công thực hiện khá đơn giản, người thực hiện chỉ cần thêm hạt từ vào mẫu, sau đó đặt tube mẫu lên chân đế nam châm để tách hạt từ dưới sự tác động của từ trường, hạn chế áp lực mẫu qua màng lọc gây tắc nghẽn. Nhờ vậy phương pháp này không cần lực ly tâm hỗ trợ nên có thể giảm được chi phí cho quá trình tách chiết. Bên cạnh đó, phương pháp này hiện nay còn được mở rộng ứng dụng vào các bộ xét nghiệm di động phù hợp với môi trường thực địa, không yêu cầu cao về điều kiện thí nghiệm. Điều lưu ý do đây là phương pháp thủ công nên chất lượng thí nghiệm phụ thuộc khá nhiều vào kỹ thuật của người thực hiện, đặc biệt là thao tác hút nhả hóa chất bằng micropipette.
4. Phương pháp tách chiết hạt từ tự động
Về nguyên tắc phương pháp tự động cũng giống với thủ công, điểm khác biệt chính đó là các bước thực hiện phần lớn được tự động hóa hoàn toàn. Quy trình sử dụng hệ thống tách chiết tự động thường bao gồm ba bước chính: Cho mẫu và hóa chất vào tube/đĩa trước khi bắt đầu, sau đó cài đặt chương trình và vận hành thiết bị, cuối cùng thu nhận nucleic acid (Hình 4). Trong tách chiết từ thủ công, hạt từ ở dạng “bị động” chịu tác dụng của lực từ trường bên ngoài, trong khi đó với các thiết bị tự động dùng cánh tay robot điều khiển các thanh từ (vai trò giống nam châm) hút/nhả hạt từ khi cần thiết, như vậy hạt từ sẽ lần lượt di chuyển một cách “chủ động” qua các bước tách chiết theo chương trình cài sẵn. Điểm khác biệt này giúp gia tăng hiệu quả tinh sạch nucleic acid cũng như giảm sự can thiệp của con người và cung cấp đầu ra chất lượng cao cho các thử nghiệm tiếp theo.
Ngoài ra, việc thực hiện hoàn toàn trong buồng máy có kèm theo hệ thống UV khử trùng giúp giảm thiểu lây nhiễm chéo. Các hệ thống tự động này còn giúp dễ dàng lặp lại thí nghiệm với các chương trình đã được lưu lại, kiểm soát tốt hơn các thông số thí nghiệm giúp tối ưu hóa quy trình tách chiết. So với các phương pháp thủ công truyền thống, các hệ thống tách chiết tự động mang lại khả năng xử lý số lượng lớn mẫu một cách nhanh chóng, tiết kiệm thời gian và công sức cho nhân viên phòng thí nghiệm mà còn nâng cao độ chính xác của kết quả phân tích.
Như vậy phương pháp tách chiết nucleic acid sử dụng hạt từ tính đã có một hành trình phát triển đáng kể trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử. Từ việc thực hiện mỗi bước công việc bằng tay đến việc sử dụng các hệ thống tự động hiện đại. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, tùy vào nhu cầu và điều kiện thí nghiệm để có những lựa chọn phù hợp trong quá trình tách chiết nucleic acid. Bảng 1 tóm gọn lại các ưu nhược điểm của cả 2 phương pháp tách chiết bằng hạt từ tính thủ công và tự động.
Bảng 1. So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp tách chiết bằng hạt từ tính thủ công và tự động
| Phương pháp tách chiết hạt từ tính | Thủ công | Tự động |
| Highlights | – Yêu cầu dụng cụ đơn giản, không cần hệ thống máy ly tâm – Chi phí thấp – Có thể ứng dụng trong xét nghiệm di động ngoài thực địa | – Đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu thao tác tay nhiều – Xử lý đồng thời số lượng mẫu lớn, giúp tiết kiệm thời gian – Hạn chế nhiễm chéo – Kiểm soát các thông số dễ dàng – Dễ dàng tối ưu hóa quy trình |
| Nhược điểm | – Yêu cầu thao tác kỹ thuật viên tốt – Hạn chế khi xử lý số lượng mẫu nhiều | – Chi phí cao |
5. Tài liệu tham khảo
1. Li, Y., Liu, S., Wang, Y., Wang, Y., Li, S., He, N., … & Chen, Z. (2023). Research on a Magnetic Separation-Based Rapid Nucleic Acid Extraction System and Its Detection Applications. Biosensors, 13(10), 903.
2. Lương Huỳnh Vủ Thanh, Thạch Trần Phương Anh, Ngô Tuấn Kiệt và Lý Đức (2021). Tổng hợp vật liệu nano Fe3O4@ SiO2 cấu trúc lõi vỏ có độ từ hóa cao. Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ, 57(3), 53-64.
