PCR kỹ thuật số (Digital PCR – dPCR) là kỹ thuật định lượng tuyệt đối axit nucleic trong nền mẫu phức tạp với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. dPCR thường được phân loại thành PCR kỹ thuật số dựa trên chip (cdPCR) and PCR kỹ thuật số dựa trên giọt/nhũ tương (ddPCR/edPCR). Bài viết này hướng dẫn thực hiện cdPCR trên hệ thống DcentriGene 160 (Bioer) và ddPCR trên hệ thống QX200™ Droplet Digital™ PCR (Bio-rad).
1. Hướng dẫn thực hiện cdPCR trên hệ thống DcentriGene 160 (Bioer)
Hệ thống phân tích PCR kỹ thuật số dựa trên chip (cdPCR) là phương pháp phân chia phản ứng vào các khoang phản ứng có thể tích siêu nhỏ nhờ bộ tạo vi giọt (MicroDrop Generator). Hỗn hợp phản ứng cdPCR được phân tách thành 10.000 đến 45.000 khoang trên một chip. Sau đó, chip được đưa vào hệ thống khuếch đại bằng máy luân nhiệt (dPCR Thermal Cycler). Tín hiệu huỳnh quang từ tất cả các khoang trên chip được ghi nhận bằng một bộ đọc vi chip (MicroChip Reader) trang bị camera công suất cao và bộ lọc huỳnh quang. Phần mềm phân tích sẽ tính toán chính xác số bản sao của trình tự mục tiêu mà không cần xây dựng đường chuẩn.
Bộ tạo vi giọt (Hình 1A) có công nghệ tạo giọt dựa trên ly tâm để phân tách mẫu thành 25.000–32.000 vi giọt đồng nhất, tối ưu hóa việc sử dụng mẫu. Máy luân nhiệt dPCR (Hình 1B) có bốn dải kiểm soát nhiệt độ độc lập, cho phép thực hiện PCR đồng thời trên bốn mẫu. Bộ đọc vi chip (Hình 1C) ghi nhận tín hiệu huỳnh quang để phân biệt vi giọt dương tính chứa gen đích đã khuếch đại và vi giọt âm tính. Phần mềm phân tích áp dụng phân bố Poisson để định lượng chính xác axit nucleic mục tiêu.
Quy trình vận hành hệ thống DcentriGene 160 của Bioer như sau:
Bước 1: Nạp mẫu vào chip tạo vi giọt
Mẫu đã tách chiết và tinh sạch được nạp vào MicroDrop Chip (Thể tích 15 µL). Sau đó, gắn các chip chứa mẫu vào thiết bị tạo giọt (Hình 1A), thiết bị này có thể tạo ra 25.000 – 32.000 giọt với 16 MicroDrop Chip tương ứng với số mẫu tối đa có thể chạy là 16 mẫu. Khi thiết bị quay ly tâm, các chip xoay làm chất lỏng chảy từ giếng vào các kênh tạo giọt. 16 giọt mẫu trải đều trên chip trong khoảng 3 phút với tỉ lệ sử dụng mẫu trên 95%.
Bước 2: Khuếch đại vi giọt
Các chip chứa vi giọt được chuyển sang thiết bị PCR để khuếch đại. Chu trình nhiệt (tăng – giảm nhiệt độ) được cài đặt riêng cho từng chip độc lập. Thiết bị có 4 vùng điều khiển nhiệt độ độc lập tạo sự đồng đều về mặt nhiệt độ giữa các mẫu. Tổng thời gian khuếch đại các vi giọt khoảng 70 phút cho 1-16 mẫu với độ chính xác ≤0.1℃.
Bước 3: Đọc tín hiệu ghi nhận
Sau quá trình khuếch đại, các MicroDrop Chip được chuyển sang thiết bị đọc tín hiệu để định tính và định lượng mẫu. Thiết bị đọc tín hiệu với 6 kênh màu tương ứng là FAM/HEX/ROX/CY5/CY5.5/CY3, các bước sóng huỳnh quang lần lượt được phát ra và thu nhận tín hiệu trên mỗi chip dựa trên công nghệ CCD để định lượng axit nucleic trong từng giọt. Thời gian phân tích 16 mẫu 6 kênh trong khoảng 25 phút và thời gian 1 kênh 1 chip dưới 10 giây.
Bước 4: Phân tích dữ liệu bằng phần mềm
Sau khi đọc tín hiệu huỳnh quang, biểu đồ tín hiệu được máy xuất ra trên phần mềm cho phép quan sát kết quả theo kênh màu lựa chọn. Phân tích thống kê Poisson cho thấy phần trên là tín hiệu các giọt dương tính và dưới là các giọt âm tính. Kết quả cũng được xuất dưới dạng bảng định lượng tuyệt đối của từng mẫu giúp người sử dụng dễ dàng đọc và phân tích kết quả.
2. Hướng dẫn thực hiện ddPCR trên hệ thống QX200 Droplet Digital PCR (Bio-Rad)
Hệ thống QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR) của Bio-Rad bao gồm thiết bị QX200 Droplet Generator dùng để phân chia mẫu từ 20 µL thành 20.000 giọt có kích thước siêu nhỏ. Máy PCR khuếch đại với chất phát quang EvaGreen hoặc đầu dò thủy phân TaqMan Probe. Máy QX200 Droplet Reader đọc tín hiệu từ các giọt để xác định mẫu dương tính và âm tính nhằm định lượng tuyệt đối lượng DNA mục tiêu.
Về cơ bản, các giọt khuếch đại chứa hóa chất và quy trình làm việc tương tự như xét nghiệm qPCR dựa trên đầu dò TaqMan. Sau khuếch đại, mỗi giọt được đọc và phân tích để xác định tỷ lệ các giọt PCR dương tính hoặc âm tính. Sau đó, dữ liệu này được phân tích bằng thống kê Poisson để xác định nồng độ khuôn mẫu DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu.
Quy trình thực hiện trên hệ thống QX200 Droplet Digital PCR của Bio-Rad được thực hiện như sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và phản ứng
Chất lượng của quá trình tách chiết axit nucleic có thể ảnh hưởng đến kết quả ddPCR. Do đó, cần sử dụng phương pháp tối ưu để tách chiết DNA hoặc RNA từ mẫu ban đầu, đảm bảo rằng mẫu không bị phân hủy. Đồng thời, quá trình tinh sạch axit nucleic nên loại bỏ tối đa các chất ức chế PCR. Trong trường hợp không thể loại bỏ hoàn toàn, có thể pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1:10 trước khi tiến hành phản ứng.
Thành phần phản ứng ddPCR về cơ bản tương tự như phản ứng PCR thông thường, bao gồm mồi, đầu dò hoặc chất phát quang, mẫu DNA và hỗn hợp master mix chứa dNTP, Mg2+, enzyme DNA polymerase…với tổng thể tích cuối cùng của phản ứng là 20 μL.
Lưu ý: Thuốc thử ddPCR trên hệ thống của Bio-Rad là sản phẩm độc quyền được phát triển dành riêng cho việc tạo giọt trên hệ thống của Bio-Rad.
Bước 2: Tạo vi giọt
Sử dụng pipet hút 20 µL thể tích hỗn hợp đã phối trộn ở trên vào các hàng giữa của DG8TM cartridge ngay vị trí đánh dấu “sample”.
Hút 70 µL dầu chuyển vào vị trí “Oil” và gắn 1 miếng đệm ở phía trên trước khi đặt cartridge vào máy tạo giọt. Một phản ứng 20 μL sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích siêu nhỏ trong khoảng 2.5 phút cho 8 mẫu. Các phân tử DNA được phân bố ngẫu nhiên vào mỗi vi giọt và trở thành 1 phản ứng riêng biệt.
Lưu ý: Để đảm bảo hút chính xác 20 µL hỗn hợp chuyển vào cartridge, nên chuẩn bị phản ứng ban đầu lớn hơn 20 µL một chút (22-25 µL). Các hỗn hợp phản ứng phải được trộn đều trước khi chuyển vào cartridge 8 giếng, trong quá trình thực hiện cần nạp cả các giếng chưa sử dụng bằng dung dịch đệm.
Bước 3: Phản ứng khuếch đại các vi giọt
Sau khi tạo thành vi giọt, tiến hành hút nhẹ nhàng các giọt tạo thành chuyển vào đĩa PCR 96 giếng. Sealing đĩa PCR 96 giếng và đặt vào máy PCR khuếch đại theo chương trình cài đặt như một phản ứng PCR truyền thống.
Bước 4: Đọc tín hiệu trong các giọt
Sau khi khuếch đại axit nucleic mục tiêu trong từng giọt, tiến hành đặt đĩa PCR vào máy đọc QX200 droplet reader. Từng vi giọt được tách ra riêng lẻ và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang bằng máy đọc giọt. Tín hiệu huỳnh quang được đo và ghi nhận cho từng giọt riêng lẻ.
Máy đọc giọt và phần mềm QuantaSoft đếm các giọt PCR dương tính và PCR âm tính để cung cấp số lượng tuyệt đối của DNA mục tiêu có trong từng giọt. Thông thường, các giọt dương tính chứa ít nhất một bản sao của phân tử DNA mục tiêu sẽ biểu hiện huỳnh quang tăng lên so với các giọt âm tính.
Bước 5: Phân tích dữ liệu
Dữ liệu trên từng giếng phải đáp ứng chất lượng nhất định trước khi phần mềm QuantSoft tự động tính toán ngưỡng mà trên đó các giọt được coi là dương tính. Ngưỡng có thể được điều chỉnh thủ công theo từng giếng hoặc trên toàn bộ đĩa.
Kết quả có thể xem dưới dạng biểu đồ 1-D, trong đó:
- Giọt dương tính: giọt (màu xanh dương) nằm trên đường ngưỡng màu đỏ được ghi là dương tính và mỗi giọt được gán giá trị là 1.
- Giọt âm tính: giọt (màu nâu) nằm dưới đường ngưỡng màu đỏ được ghi là âm tính và mỗi giọt được gán giá trị là 0.
Ngoài ra, kết quả có thể xem ở dạng biểu đồ 2-D plot khuếch đại đồng thời hai mục tiêu. Phần mềm QuantaSoft™ đo số giọt dương và âm cho từng chất huỳnh quang trong mỗi mẫu. Sau đó, phần mềm tính toán với thuật toán Poisson để xác định nồng độ ban đầu của phân tử DNA mục tiêu theo đơn vị bản sao/µL đầu vào.
Nhìn chung, sự kết hợp giữa các công nghệ khác nhau như chip vi lưu và giọt/nhũ tương nước trong dầu đã thu hút được nhiều sự quan tâm và chứng minh được lợi ích của tự động hóa, tích hợp và thu nhỏ quy mô ứng dụng cho nhiều hướng nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị.
3. Tài liệu tham khảo
Bioer Technology, Droplet Chip Digital PCR Analysis System, https://en.bioer.com/uploadfiles/2025/01/20250122083714882.pdf
Bio-Rad, Droplet Digital TM PCR Applications Guide, https://www.gene-quantification.de/bio-rad-ddpcr-app-guide-6407.pdf
Bio-Rad, Droplet Digital PCR (ddPCR) Technology, https://www.bio-rad.com/en-vn/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/what-is-droplet-digital-pcr?ID=MDV31M4VY
