TRISURE REAGENT

Giới thiệu TRISURE REAGENT

Trisure reagent là một thuốc thử hoàn chỉnh, có thể sử dụng ngay, được dùng để phân lập DNA, RNA và protein từ các mẫu sinh học như mẫu mô trên người, động vật, thực vật, nấm men, vi khuẩn và virus.

Sau khi sử dụng Trisure reagent, mẫu sẽ được đồng nhất, ly giải và phân tách thành ba pha: pha nước không màu phía trên chứa RNA, pha giữa chứa DNA và pha hữu cơ màu đỏ bên dưới chứa protein.

RNA được chiết xuất từ pha nước bằng cách tủa cồn 2-propanol. Đặc tính ức chế RNase hiệu quả cao của Trisure reagent giúp bảo vệ tính toàn vẹn của RNA trong quá trình ly giải và dẫn đến việc phân lập vật liệu chất lượng cao.

DNA được thu nhận từ pha giữa bằng phương pháp tủa cồn Ethanol. Trong khi đó, protein được thu nhận thông qua kết tủa liên tiếp từ phần nổi Phenol-Ethanol bằng cách tủa cồn 2-propanol.

Hướng dẫn sử dụng

1. Chuẩn bị mẫu

– Mẫu mô:

• Cho 50-100 mg mẫu mô đồng nhất vào tube 1.5 ml cùng với 1 ml Trisure reagent.
• Lưu ý: Vortex thường xuyên trong quá trình ủ.

– Mẫu tế bào đơn lớp:

• Sử dụng 1 ml Trisure reagent trên 10cm² diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy thủy tinh
• Lưu ý: Không sử dụng Trisure reagent trên đĩa cấy nhựa.

– Mẫu tế bào miễn dịch:

• Phân lập tế bào bằng cách ly tâm, hút cho vào thuốc thử Trisure reagent và trộn đều bằng pipet.
• Sử dụng 1 ml thuốc thử để ly giải 10⁵ – 10⁶ tế bào động vật, thực vật, nấm men hoặc tế bào vi khuẩn

2. Tách pha

• Bước 1: Để mẫu yên trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
• Bước 2: Thêm 0,1 ml 1-bromo-3-chloropropane hoặc 0,2 ml chloroform vào 1 ml Trisure reagent.
• Bước 3: Đậy kín mẫu, lắc mạnh trong 15 giây và để yên trong 2–15 phút ở nhiệt độ phòng.
• Bước 4: Ly tâm hỗn hợp thu được ở 12.000xg trong 15 phút ở 2-8°C.

Quá trình ly tâm phân tách hỗn hợp thành 3 pha: pha hữu cơ màu đỏ (chứa protein), pha giữa (chứa DNA) và pha nước phía trên không màu (chứa RNA).

3. Phân lập và tách chiết RNA

• Bước 1: Chuyển pha nước sang ống mới, thêm 0.5 ml 2-propanol với 1ml Trisure reagent được sử dụng trong bước Chuẩn bị mẫu và trộn đều.
• Bước 2: Để yên trong 5-10 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm ở 12,000xg trong 10 phút ở 2-8°C.
• Bước 3: Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa lớp cặn RNA bằng cách thêm 1 mL Ethanol 75% ứng với 1ml Trisure reagent được sử dụng trong bước Chuẩn bị mẫu.
• Bước 4: Đảo trộn bằng cách votex mẫu và sau đó ly tâm ở 7.500xg trong 5 phút ở 2–8°C.
• Bước 5: Làm khô nhanh lớp cặn RNA trong 5-10 phút bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc trong chân không.
• Bước 6: Thêm một lượng thích hợp formamide, nước hoặc dung dịch SDS 0.5% vào lớp tủa RNA. Để hòa tan dễ dàng, hút trộn nhiều lần bằng pipet ở 55-60°C trong 10-15 phút.

4. Phân lập và tách chiết DNA

• Bước 1: Cẩn thận loại bỏ pha nước còn lại phía trên pha giữa. Thêm 0.3 ml Ethanol 100% ứng với 1ml Trisure reagent được sử dụng trong bước Chuẩn bị mẫu. Đảo trộn và để yên trong 2-3 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, ly tâm ở 2,000xg trong 5 phút ở 2-8°C để thu lớp kết tủa DNA từ pha giữa và pha hữu cơ.
• Bước 2: Rửa lớp kết tủa DNA hai lần trong dung dịch 0,1M trisodium citrate, dung dịch Ethanol 10%. Sử dụng 1ml dung dịch rửa ứng với mỗi 1ml Trisure reagent được sử dụng trong Chuẩn bị mẫu. Quá trình rửa ít nhất 30 phút cho mỗi lần, thỉnh thoảng hút trộn nhẹ và không làm vỡ lớp tủa DNA.
• Bước 3: Ly tâm ở 2,000xg trong 5 phút ở 2-8°C. Bảo quản DNA trong Ethanol 75% từ 1,5–2ml cho mỗi ml Trisure reagent và giữ yên trong 10–20 phút ở nhiệt độ phòng.
• Bước 4: Làm khô lớp tủa DNA trong 5-10 phút trong chân không và hòa tan trong 8 mM NaOH bằng cách hút trộn.
• Bước 5: Ly tâm ở 12.000×g trong 10 phút để loại bỏ chất không hòa tan và chuyển dịch nổi phía trên sang một ống mới.

     a. Khuếch đại DNA bằng PCR

Sau khi hòa tan trong 8mM NaOH, điều chỉnh pH đạt 8,4 bằng HEPES, free acid (thêm 86μL 0,1M HEPES/ml dung dịch DNA). Bổ sung mẫu (khoảng 0,1–1μg) vào hỗn hợp PCR và thực hiện theo quy trình PCR.

     b. Phân loại DNA với Enzyme cắt giới hạn

Điều chỉnh độ pH của dung dịch DNA đến độ pH cần thiết hoạt động của enzyme cắt giới hạn bằng cách sử dụng HEPES, hoặc thẩm tách mẫu bằng EDTA 1mM, pH 7–8. Ủ mẫu với enzyme trong 3–24 giờ trong điều kiện tối ưu.

5. Phân lập Protein

• Bước 1: Kết tủa protein thu từ phần nổi Phenol-Ethanol ở bước Phân lập DNA với 1,5 ml 2-propanol ứng với 1 ml Trisure reagent được sử dụng trong Chuẩn bị mẫu. Để mẫu yên ít nhất 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở 12.000×g trong 10 phút ở 2–8°C.
• Bước 2: Đổ bỏ phần dịch nổi phía trên và rửa lớp tủa 3 lần, mỗi lần 20 phút trong hồn hợp dung dịch Guanidine hydrochloride 0,3M với dung dịch Ethanol 95% ở nhiệt độ phòng, sử dụng 2 ml hỗn hợp dung dịch rửa ứng với 1 ml Trisure reagent được sử dụng trong Chuẩn bị mẫu.
• Bước 3: Ly tâm ở 7.500xg trong 5 phút ở 2–8°C. Sau 3 lần rửa, thêm 2ml Ethanol 100% và votex. Sau đó, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở 7.500×g trong 5 phút ở 2–8°C.
• Bước 4: Làm khô tủa protein trong chân không trong 5–10 phút. Hút trộn với dung dịch SDS 1% để hòa tan protein. Ly tâm ở 10.000xg trong 10 phút ở 2–8°C để loại tạp chất khác, không tan. Chuyển phần nổi phía trên sang một ống mới. Dung dịch protein nên được sử dụng ngay lập tức để thực hiện Western blotting hoặc được bảo quản ở –20°C.

Tham khảo thêm:

• Các hóa chất khác
• Hướng dẫn sử dụng