PCR Kỹ Thuật Số (dPCR) và Droplet Digital PCR (ddPCR): Nguyên lý, Ưu điểm và Ứng dụng

Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã phát triển qua ba thế hệ:

• PCR thế hệ đầu tiên: Sử dụng điện di gel để phân tích sản phẩm khuếch đại. Tuy nhiên, độ nhạy thấp và quy trình phức tạp khiến nó chỉ phù hợp cho các ứng dụng định tính.
• PCR định lượng thời gian thực (RT-qPCR): Giúp định lượng gene dựa trên đường chuẩn. Tuy nhiên, nó vẫn dễ bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế trong mẫu.
• PCR kỹ thuật số (dPCR): Là bước tiến vượt bậc khi cho phép định lượng gene tuyệt đối với độ chính xác cao mà không cần đường chuẩn. Nhờ đó, kỹ thuật này trở thành lựa chọn lý tưởng cho các nghiên cứu yêu cầu độ nhạy cao.

1. PCR kỹ thuật số (digital PCR –  dPCR) là gì?

Digital PCR hay PCR kỹ thuật số (dPCR) là phương pháp chia hỗn hợp phản ứng PCR thành hàng nghìn phản ứng đơn lẻ có thể tích cực nhỏ (độ chính xác đến nanomét). Khuôn mẫu axit nucleic được phân bố ngẫu nhiên và mỗi vùng có thể chứa một vài hoặc không có trình tự mục tiêu.

Sau khi khuếch đại, mục tiêu được phát hiện vào cuối quá trình PCR bằng cách đo sự có mặt hoặc không có huỳnh quang của các đầu dò DNA đặc hiệu trình tự hoặc thuốc nhuộm xen kẽ:
– Phản ứng dương tính: phát huỳnh quang (ghi là 1), màu sáng
– Phản ứng âm tính: không phát huỳnh quang (ghi là 0), màu tối

Vì phản ứng PCR được phân vùng ngẫu nhiên nên có khả năng phản ứng dương tính chứa nhiều hơn một phân tử mục tiêu. Để tính đến các phản ứng vi mô với nhiều hơn một trình tự khuôn mẫu, thống kê Poisson được áp dụng để hiệu chỉnh số liệu.

Ví dụ thực tế:
Tổng phản ứng dPCR là 12 µL gồm: 5 µL mẫu DNA + 3 µL master mix và 4 µL mồi. Sau khi chạy hệ thống PCR kỹ thuật số có kết quả định lượng 4000 phân vùng dương trong số 8000 phân vùng hợp lệ.

2. So sánh PCR kỹ thuật số và PCR định lượng theo thời gian thực

Giống như bất kỳ kỹ thuật nào, PCR kỹ thuật số cũng có những lợi ích và hạn chế riêng. Bảng dưới đây tóm tắt ưu và nhược điểm của PCR kỹ thuật số so với PCR định lượng theo thời gian thực.

Bảng 1 – Đánh giá ưu nhược điểm của PCR kỹ thuật số và PCR định lượng theo thời gian thực

3. Sự hình thành và phát triển của PCR kỹ thuật số vi giọt (Droplet digital PCR – ddPCR)

3.1. Nguyên lý hoạt động của ddPCR

PCR kỹ thuật số vi giọt (Droplet Digital PCR – ddPCR) là một dạng của PCR kỹ thuật số được Sykes đề xuất lần đầu tiên vào năm 1992 dựa trên việc kết hợp giữa phân phối Poisson và phương pháp phân vùng mẫu đến mức vi mô đơn lẻ.

Nguyên lý của ddPCR phân chia hỗn hợp phản ứng PCR thành các đơn vị phản ứng nhỏ hơn thông qua tấm vi giếng, mao quản hoặc sử dụng chất lỏng không hòa tan trong dầu (nhũ tương nước-dầu) tạo ra hàng chục nghìn vi giọt. Mẫu ban đầu được phân chia ngẫu nhiên trong các vi giọt có kích thước nanolit tạo thành các phản ứng nhỏ độc lập cho phép đo hàng nghìn sự khuếch đại trong một phản ứng.

Như vậy, mỗi vi giọt về cơ bản giống như các ống nghiệm hoặc giếng riêng lẻ trong một đĩa và  phản ứng PCR diễn ra trong từng giọt tạo thành. Điều này tạo ra sự khác biệt với PCR truyền thống một mẫu chỉ cung cấp một phép đo duy nhất.

Sau khi khuếch đại, các vi giọt được phân tích bằng cách đo sự có mặt hoặc không có huỳnh quang của các đầu dò đặc hiệu trình tự hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang chèn. Từ đó xác định số lượng vi giọt phản ứng dương tính và âm tính trong mẫu ban đầu. Nồng độ DNA/RNA mục tiêu có trong mẫu được tính toán bằng cách sử dụng thống kê Poisson (Hình 2).

Thành phần phản ứng ddPCR

ddPCR là sự kết hợp giữa PCR và Real-time PCR, vậy nên các thành phần cơ bản của một phản ứng ddPCR cơ bản, bao gồm:

• DNA khuôn mẫu
• Cặp mồi đặc hiệu
• Master mix (DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, buffer)
• Đầu dò huỳnh quang

Quy trình cơ bản

• Chuẩn bị thành phần của phản ứng PCR, sau đó sử dụng một thiết bị chuyên dụng để chia nhỏ ống phản ứng gốc thành hàng nghìn vi giọt đồng nhất về kích thước và thể tích. Số lượng phản ứng được phân chia càng lớn thì năng lực phân biệt của phương pháp càng tốt. Trên thị trường hiện nay, ddPCR sử dụng phổ biến dòng máy hãng Biorad (QX200 Droplet Generator) có khả năng chia mẫu thành 20.000 vi giọt. Ngoài ra, hệ thống phân tích PCR kỹ thuật số chip nhỏ giọt hãng Bioer (Droplet Chip Digital PCR Analysis System FDD-16A) chia mẫu thành 25.000-32.000 vi giọt.
• Chuyển vi giọt tạo thành vào máy PCR để khuếch đại các vi giọt với cùng một chu trình nhiệt PCR.
• Sau khuếch đại, sử dụng thiết bị chuyên dụng đo cường độ huỳnh quang và thu nhận tín hiệu ở từng phản ứng nhỏ và mã hóa dữ liệu bằng dạng biểu đồ.
• Kết quả được đọc vi giọt được chuyển sang máy tính phân tích. Tính nồng độ acid nucleic mục tiêu có trong mẫu dựa trên thống kê Poisson tính tỷ lệ phản ứng dương tính thu nhận (độ tin cậy 95%).

ddPCR cho phép phát hiện nồng độ DNA rất thấp với độ nhạy cao. Ngoài ra, công nghệ này đã được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện mầm bệnh, xác định đột biến gen, phân tích biến thể số bản sao gen, đo lường mức độ biểu hiện mRNA và nghiên cứu chỉnh sửa DNA.

4. Một số ứng dụng của ddPCR

ddPCR ngày càng được ưa chuộng nhờ độ nhạy và khả năng định lượng chính xác. Một số ứng dụng tiêu biểu gồm:

• Ung thư học: Phát hiện ung thư phổi, vú, cổ tử cung, phân tích sinh thiết lỏng, đánh giá đáp ứng điều trị
• Phát hiện đột biến và gene hiếm: Xác định các đột biến kháng thuốc, giải trình tự gene với độ chính xác cao
• Chẩn đoán di truyền: Xét nghiệm NIPT* phát hiện DNA thai nhi trong máu mẹ (cffDNA), phát hiện hội chứng Down và các rối loạn di truyền
• Giải pháp kiểm tra nước thải: Xét nghiệm ddPCR nhắm vào gen mã hóa (Vd: carbapenemase) trong nước thải nhằm xác định sự phong phú của vi khuẩn kháng thuốc và gen kháng carbapenem.
• Phát hiện mầm bệnh và phân tích hệ vi sinh vật: VD phát hiện các đoạn DNA đặc hiệu MTB trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân lao (TB) bằng ddPCR với độ nhanh và chính xác.
• Giải trình tự thế hệ mới (NGS): VD kiểm tra sinh thiết lỏng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (CRCs) để xác định đột biến kháng thuốc

(*) Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (NIPT): Xác định cell-free fetal DNA (cffDNA) trong huyết tương của mẹ ở mức độ cực kì thấp (chỉ chiếm 10-20% tổng số protein huyết tương), dự đoán các bệnh di truyền thông qua các gen mục tiêu.

Droplet Digital PCR là giải pháp lý tưởng cho các nghiên cứu đòi hỏi độ nhạy, độ chính xác và khả năng định lượng tuyệt đối. Với sự hỗ trợ từ các hệ thống thiết bị hiện đại, ddPCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu, lâm sàng và công nghiệp sinh học.

Tài liệu tham khảo

1. https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/bench-guide/pcr/digital-pcr/what-is-digital-pcr
2. https://www.bio-rad.com/en-vn/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/what-is-droplet-digital-pcr
3. https://en.bioer.com/en/InstrumentCenter/info.aspx?itemid=3169
4. https://www.bio-rad.com/en-vn/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/applications-of-digital-pcr