PCR kỹ thuật số vi giọt (droplet digital PCR – ddPCR) được đánh giá là công nghệ có độ nhạy và độ chính xác cao, đặc biệt phù hợp cho phát hiện đồng thời nhiều mầm bệnh trong mẫu thủy sản. Tuy nhiên, để đạt hiệu suất khuếch đại tối ưu và phân tách rõ ràng giữa giọt dương tính và âm tính, việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng ddPCR là bước bắt buộc.
Bài viết này hướng dẫn phương pháp tối ưu hóa điều kiện của phản ứng ddPCR kép nhằm phát hiện đồng thời Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây hội chứng chậm lớn và Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm.
Bài viết tham khảo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Zhang và cộng sự (2022) trên tạp chí Journal of Fish Diseases. Quy trình tối ưu hoá ddPCR gồm các bước tham khảo như sau [1]
1. ddPCR trong chẩn đoán bệnh trên tôm
Droplet digital PCR (ddPCR) là một kỹ thuật khuếch đại axit nucleic cho phép định lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn, đồng thời có độ nhạy và độ chính xác rất cao.
Đọc thêm: PCR Kỹ Thuật Số (dPCR) và Droplet Digital PCR (ddPCR) là gì?
Sau khuếch đại, các giọt được phân loại:
- Giọt dương tính (có tín hiệu huỳnh quang)
- Giọt âm tính (không phát tín hiệu huỳnh quang)
Dựa trên phân bố Poisson, hệ thống sẽ tính toán số bản sao DNA mục tiêu một cách định lượng tuyệt đối, không cần đường chuẩn.
Ưu điểm của ddPCR trong thủy sản:
- Độ nhạy cao hơn qPCR ở nồng độ thấp
- Ít bị ảnh hưởng bởi chất ức chế từ mẫu tôm
- Phù hợp cho phát hiện đồng thời nhiều tác nhân
- Phân tách rõ ràng giữa tín hiệu dương và âm
Tuy nhiên, để đạt được sự phân tách tối ưu giữa các giọt, cần tối ưu các yếu tố như nồng độ mồi, đầu dò và nhiệt độ lai, v.v.
2. Quy trình tối ưu hóa ddPCR phát hiện EHP và VPAHPND
2.1. Lựa chọn gene mục tiêu
Phản ứng khuếch đại gene mục tiêu trong quy trình ddPCR tuân theo các nguyên tắc tương tự như qPCR. Cụ thể sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 60 – 200 bp, hàm lượng GC từ 40-60% và tránh các vùng có cấu trúc thứ cấp.
Hai gene mục tiêu được lựa chọn gồm:
- EHP: Gene SWP (spore wall protein 1; GeneBank No. MH365434.1)
- VPAHPND: Gene pirA
2.2. Thiết kế mồi và đầu dò (probe)
Đọc thêm: Tiêu chuẩn thiết kế mồi và đầu dò.
Trong quy trình này, các đoạn mồi và đầu dò được thiết kế bằng Phần mềm Primer Express® (Phiên bản 3.0.1, Applied Biosystems, Foster City, CA, Hoa Kỳ ) như trong Bảng 1.
Bảng 1. Trình tự mồi và đầu dò của phương pháp ddPCR định lượng EHP và VPAHPND
Tính đặc hiệu của mồi và đầu dò được kiểm tra bằng BLAST https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
Cấu trúc thứ cấp của mồi và đầu dò như cấu trúc kẹp tóc hairpin hoặc dimer được kiểm tra bằng phần mềm Oligo Analyser (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)
Đầu dò phát hiện tác nhân EHP được gắn với chất phát huỳnh quang (reporter) là FAM và chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) là MGB. Trong khi đầu dò phát hiện tác nhân VPAHPND được gắn chất phát huỳnh quang là VIC và chất hấp phụ huỳnh quang là MGB.
Đọc thêm: Cách lựa chọn reporter và quencher phù hợp cho đầu dò
2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ddPCR
Phản ứng tối ưu hoá điều kiện cho một phản ứng vi giọt ddPCR được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Bio-Rad). Quy trình tham khảo như sau:
Chuẩn bị thành phần phản ứng ddPCR: Tổng thể tích 20 μl bao gồm 10 μl 2×ddPCR™ Supermix probe (Bio-Rad), 400 – 500 nM mồi và 200 – 300 nM đầu dò (1 μl khuôn mẫu và bổ sung nước cất 2 lần ddH2O lên đến 20 μl).
Tối ưu hoá nồng độ mồi và đầu dò: Các nồng độ mồi và đầu dò được tối ưu hoá gồm:
- Mồi 500 nM và đầu dò 250 nM
- Mồi 500 nM và đầu dò 300 nM
- Mồi 500 nM và đầu dò 200 nM
- Mồi 400 nM và đầu dò 200 nM
Tạo vi giọt: Máy tạo giọt QX200™ droplet generator (Bio-Rad, USA) được sử dụng để tạo vi giọt.
Đọc thêm: Quy trình thực hiện PCR kỹ thuật số dựa trên chip và trên giọt/nhũ tương.
Phản ứng khuếch đại các vi giọt: Các giọt sau khi hình thành được chuyển sang đĩa PCR 96 giếng (Bio-Rad, Hoa Kỳ) để khuếch đại tác nhân mục tiêu. Nhiệt độ lai (annealing temperature) của mồi được tối ưu hoá từ 55 đến 620C nhằm liên kết với trình tự DNA mục tiêu giúp tăng độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại, từ đó tăng khả năng phân biệt giữa các giọt dương tính và âm tính.
Quy trình PCR bao gồm:
– 1 chu kỳ: 95°C trong 10 phút
– 40 chu kỳ: 94°C trong 30 giây
55 – 62°C trong 60 giây
– 1 chu kỳ: 98°C trong 10 phút, giữ ở 4°C
Đọc tín hiệu trong các giọt: Sau khi khuếch đại PCR, các giọt được đọc riêng biệt bằng hệ thống QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, Hoa Kỳ) và phân tích bằng phần mềm QuantaSoft™ (Bio-Rad, Hoa Kỳ).
3. Đọc và phân tích kết quả tối ưu mồi và đầu dò cho PCR kỹ thuật số vi giọt ddPCR
Nghiên cứu cụ thể của Zhang và cộng sự (2022) trình bày kết quả tối ưu hóa nồng độ mồi và đầu dò cho phương pháp PCR kỹ thuật số vi giọt (ddPCR) đối với hai đối tượng là EHP và VPAHPND.
Tổng 8 mẫu (lane 1 đến 8) với các điều kiện khác nhau về nồng độ mồi và đầu dò, bao gồm:
- Lane 1 & 2: 500 nM mồi + 250 nM đầu dò (lặp lại 2 lần)
- Lane 3 & 4: 500 nM mồi + 300 nM đầu dò (lặp lại 2 lần)
- Lane 5 & 6: 500 nM mồi + 200 nM đầu dò (lặp lại 2 lần)
- Lane 7 & 8: 400 nM mồi + 200 nM đầu dò (lặp lại 2 lần)
Kết quả cho thấy khi sử dụng nồng độ 500 nM mồi và 300 nM đầu dò (lane 3 và 4) cho các giọt dương tính và âm tính được phân tách rõ ràng so với đường ngưỡng với cả EHP và VPAHPND. Như vậy, nồng độ 500 nM mồi và 300 nM đầu dò là điều kiện tối ưu của mồi và đầu dò cho phản ứng ddPCR.
Tín hiệu của giọt âm tính ở VPAHPND (hình b) cao hơn so với EHP (hình a) do quencher MGB hoạt động hiệu quả hơn với thuốc nhuộm FAM (dùng cho EHP) so với VIC (dùng cho VPAHPND).
4. Đọc và phân tích kết quả tối ưu nhiệt độ lai cho PCR kỹ thuật số vi giọt ddPCR
Tối ưu hóa nhiệt độ lai cho hai đối tượng EHP và VPAHPND ở nhiệt độ khảo sát từ 55°C (lanes 1 & 2), 55.9°C (lanes 3 & 4), 58.3°C (lanes 5 & 6), 59°C (lanes 7 & 8) và 62.1°C (lanes 9 & 10).
Đối với EHP, khi nhiệt độ lai tăng dần thì khoảng cách giữa các giọt dương tính và âm tính dần thu hẹp dẫn đến sự phân tách tín hiệu không rõ ràng. Ở mức nhiệt độ 55°C (lanes 1 và 2), sự phân tách giữa giọt dương và giọt âm là rõ ràng nhất cho thấy điều kiện này là tối ưu để khuếch đại đặc hiệu và chính xác tác nhân EHP mục tiêu
Đối với VPAHPND, nhiệt độ lai có ảnh hưởng không đáng kể đến sự phân tách giữa các giọt dương tính và âm tính, tín hiệu vẫn ổn định ở các mức nhiệt độ khác nhau.
Do đó, nhiệt độ 55°C được chọn là nhiệt độ lai mồi tối ưu cho cả hai tác nhân đích (EHP và VPAHPND) trong phản ứng ddPCR.
Như vậy, phương pháp tối ưu hóa điều kiện của một phản ứng ddPCR là phương pháp giúp chọn lựa và điều chỉnh các điều kiện tối ưu bao gồm nồng độ mồi, nồng độ đầu dò, nhiệt độ lai để phản ứng đạt hiệu suất khuếch đại cao nhất. Phản ứng ddPCR tối ưu giúp tiết kiệm hoá chất, giảm số lần lặp lại do lỗi kỹ thuật từ đó tiết kiệm chi phí và tăng độ chính xác định lượng.
5. Tài liệu tham khảo
Zhang, H., Gong, H. Y., Cao, W. W., Que, M. Y., Ye, L., & Shi, L. (2022). Duplex droplet digital PCR method for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei and Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease. Journal of fish diseases, 45(6), 761–769. https://doi.org/10.1111/jfd.13600