Giới thiệu ABT ® GRAM STAINING KIT
ABT ® Gram Staining Kit được thiết kế cho việc nhuộm và phân biệt các vi khuẩn gram dương (tím đến tím đen) và gram âm (hồng tới đỏ) trong mẫu vi khuẩn nuôi cấy và bệnh phẩm dùng trong xét nghiệm hỗ trợ chẩn đoán nhiễm trùng hoặc các nghiên cứu vi sinh.
Loại mẫu: vi khuẩn nuôi cấy hoặc các loại mẫu bệnh phẩm.
Khả năng nhuộm màu: Các tế bào vi khuẩn được nhuộm với bộ kit cho màu tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn gram dương (tím đến tím đen) và gram âm (hồng đến đỏ).
Khả năng phát hiện: Các mẫu vi khuẩn nuôi cấy và mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý và nhuộm với bộ kit phát hiện được nhiều loại vi khuẩn gram dương và gram âm với các hình dạng, kích thước khác nhau. Đồng thời, sau khi nhuộm bộ kit giúp trực quan hóa vi nấm trong mẫu bệnh phẩm.
Nguyên lý hoạt động:
– Dựa trên sự khác biệt về sự hiện diện lớp peptidoglycan của vi khuẩn gram âm và gram dương dẫn đến khác biệt nhau về khả năng giữ màu thuốc nhuộm tinh thể.
– Quy trình nhuộm của ABT ® Gram Staining Kit gồm có 4 bước chính:
- Đầu tiên, các tế bào vi khuẩn sau khi được cố định sẽ được nhuộm với Crystal violet Solution, các tinh thể thuốc nhuộm sẽ liên kết với các protein tích điện âm của thành phần lớp peptidoglycan của vi khuẩn.
- Tiếp theo, các tế bào được cố định trong Lugol Solution, giúp hình thành phức hợp Crystal violet – Iodine (CV-I) góp phần cố định và khóa chặt thuốc nhuộm Crystal violet trên lớp peptidoglycan của vi khuẩn.
- Tiếp theo, các tế bào vi khuẩn được biệt hóa màu gram bằng Decolorizer Solution, hỗn hợp cồn và aceton giúp loại bỏ lớp màng ngoài ở vi khuẩn gram âm và tẩy phức hợp CV-I trên các tế bào vi khuẩn gram âm. Ở vi khuẩn gram dương lớp peptidoglycan giúp cho phức hợp CV-I được giữ lại và không bị rửa trôi như gram âm cho màu tím đến đen sau khi nhuộm.
- Cuối cùng, các tế bào vi khuẩn được nhuộm phân biệt bằng Safranin O Solution, đây là hỗn hợp thuốc nhuộm tích điện dương liên kết với các protein tích điện âm bên trong bào tương vi khuẩn giúp trực quan hóa màu sắc vi khuẩn gram âm cho màu hồng đến đỏ sau khi nhuộm.
Hạn sử dụng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất.
Bảo quản: Nhiệt độ 15 – 30℃, tránh sáng trực tiếp.
Thành phần bộ kit:
| STT | THÀNH PHẦN BỘ KIT | SỐ LƯỢNG |
| 1 | Crystal Violet Solution | 1×100 mL |
| 2 | Lugol Solution | 1×100 mL |
| 3 | Decolorizer Solution | 1×100 mL |
| 4 | Safranin O Solution | 1×100 mL |
Quy trình thực hiện
1. Chuẩn bị tiêu bản:
– Chuẩn bị lam kính: lam kính được nhúng Ethanol 96%, để ráo và hơ qua ngọn lửa đèn cồn để làm sạch. Ghi chú thông tin mẫu bệnh phẩm bằng bút chì hoặc dán nhãn ở đầu nhám của lam kính.
– Phết lam: mẫu vi khuẩn nuôi cấy (khuẩn lạc, dịch nuôi cấy lỏng) và mẫu bệnh phẩm (dịch cơ thể, nước tiểu, mẫu đờm, mẫu phết bề mặt và mẫu mô,…) được tiền xử lý và đồng nhất theo khuyến cáo của Bộ Y tế Việt Nam (Quyết định số 1539/QĐ-BYT) hoặc một số văn bản chuyên ngành quy định trong lĩnh vực thú y, thủy sản hoặc nghiên cứu.
Quy trình phết lam được thực hiện như sau:
- Bước 1: Hút khoảng 5 – 10 µL dịch mẫu đã xử lý và cho trực tiếp lên lam kính (đối với mẫu phết bề mặt thì phết trực tiếp lên lam kính).
- Bước 2: Giàn đều dịch mẫu trên lam kính theo hình xoáy ốc từ trong ra ngoài hoặc đường xoắn ốc (đối với mẫu nước tiểu không cần giàn đều).
- Bước 3: Cố định tiêu bản bằng cách để khô tự nhiên sau đó hơ nhẹ mặt dưới lam kính (mặt không có vi khuẩn) qua lại trên ngọn lửa đền cồn 2 – 3 lần (cố định nhiệt) hoặc nhúng vào Methanol 99,5% trong 1 phút (cố định cồn).
Lưu ý:
- Mẫu phải được giàn đều trên lam kính, tránh vết phết quá dày hoặc quá mỏng sẽ ảnh hưởng sự nhuộm màu.
- Mẫu phải được xử lý và cố định trong khoảng 24 – 48 giờ sau khi thu nhận để tránh vi khuẩn bị suy thoái.
- Quá trình cố định mẫu bằng nhiệt phải được thực hiện nhanh, tránh làm ảnh hưởng đến lớp gram và gây biến dạng vi khuẩn.
2. Nhuộm gram tiêu bản:
– Tiến hành nhuộm gram tiêu bản đã xử lý theo quy trình sau:
- Bước 1: Nhuộm Crystal violet Solution trong 30 giây và rửa bằng nước máy.
- Bước 2: Cố định mẫu bằng Lugol Solution trong 30 giây và rửa bằng nước máy.
- Bước 3: Tẩy màu thừa tiêu bản bằng Decolorizer Solution trong 30 giây và rửa bằng nước máy.
- Bước 4: Nhuộm Safranin O Solution trong 1 phút và rửa bằng nước máy.
- Bước 5: Thu nhận lam kính và để khô lam tự nhiên.
Lưu ý:
- Hóa chất được cho trực tiếp khoảng 0,5 – 1,0 mL trở lên sao cho bao phủ hoàn toàn vết phết.
- Nước máy dùng để rửa tiêu bản sau mỗi lần xử lý hóa chất có pH = 7 – 7,5. Trường hợp nước máy có pH vượt khoảng này có thể sử dụng nước cất 2 lần để thay thế.
- Quá trình bổ sung và rửa hóa chất trên lam kính hạn chế tác động trực tiếp vào mẫu có thể làm bong tróc và trôi mẫu, đặc biệt là vi khuẩn gram âm.
3. Phân tích kết quả:
Thực hiện phân tích kết quả dưới kính hiển vi quang học. Quan sát ở vật kính 10x và 40x để đánh giá tình trạng nhuộm và tẩy màu của tiêu bản. Quan sát ở vật kính 100x (bổ sung dầu soi kính) để đánh giá hình dạng, kích thước, màu gram của vi khuẩn: vi khuẩn gram dương bắt màu tím đến tím đen và vi khuẩn gram âm bắt màu hồng đến đỏ.
Tham khảo thêm: Hóa chất ABT ; Video HDSD kit ABT
Đánh giá
Chưa có đánh giá nào.