Dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) là một bệnh do virus có khả năng lây nhiễm rất cao, gây ra tỷ lệ tử vong gần như 100% trên lợn nhà và đang là mối đe dọa kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Virus ASF có 24 kiểu gen đã được xác định, trong đó kiểu gen II có độc lực cao đang lưu hành rộng rãi tại châu Âu và châu Á, bao gồm cả Đông Nam Á. Việc phát triển một công cụ chẩn đoán phân tử nhanh và đáng tin cậy là cực kỳ quan trọng để có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát kịp thời.
Các phương pháp truyền thống như phân lập virus rất tốn thời gian, trong khi PCR truyền thống lại có độ nhạy thấp và đòi hỏi các bước xử lý sau phản ứng. Các công nghệ mới hơn như LAMP hay RPA tuy có tiềm năng nhưng thiết kế mồi phức tạp và độ nhạy chưa cao bằng PCR. Real-time PCR hiện là công nghệ được sử dụng rộng rãi nhất nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội.
- Tốc Độ Vượt Trội: Real-time PCR có thể cung cấp kết quả chẩn đoán chính xác trong vòng chưa đầy 4 giờ kể từ khi mẫu đến phòng thí nghiệm. Tốc độ này cho phép các nhà quản lý trang trại và cơ quan thú y đưa ra các biện pháp can thiệp ngay lập tức—cách ly, khoanh vùng, khử trùng—nhằm ngăn chặn virus lây lan rộng.
- Độ Nhạy Tối Ưu: Một trong những ưu điểm lớn nhất của Real-time PCR là khả năng phát hiện một lượng rất nhỏ vật liệu di truyền (DNA) của virus. Điều này có nghĩa là có thể phát hiện lợn nhiễm bệnh ngay cả trong giai đoạn đầu, thường là trước khi chúng biểu hiện các triệu chứng lâm sàng rõ ràng. Việc phát hiện sớm này là yếu tố then chốt để dập tắt ổ dịch.
- Độ Đặc Hiệu Cao: Xét nghiệm Real-time PCR sử dụng các đoạn mồi (primer) và mẫu dò (probe) được thiết kế đặc biệt để chỉ bám vào DNA của ASFV, cụ thể là gene B646L (p72) có tính bảo tồn cao. Điều này giúp giảm thiểu tối đa nguy cơ dương tính giả do nhầm lẫn với các virus khác, mang lại kết quả có độ tin cậy cao để bạn đưa ra những quyết định quan trọng.
Real-time PCR không chỉ nhanh hơn, nó còn an toàn hơn và đáng tin cậy hơn, trở thành công cụ được Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH) và các cơ quan thú y hàng đầu khuyến nghị cho việc chẩn đoán ASFV.
1. Loại mẫu sử dụng cho xét nghiệm ASFV
1.1. Mẫu máu toàn phần, huyết thanh, cơ quan nội tạng
Máu toàn phần (không sử dụng ống chứa heparin vì sẽ gây ức chế phản ứng, huyết thanh (không chứa chất chống đông EDTA và heparin), lách, hạch bạch huyết, và Amidan, thận từ lợn là những mẫu được lựa chọn hàng đầu do có tải lượng virus cao.
1.2. Các loại mẫu khác cho giám sát
Dịch miệng thu thập bằng dây thừng là một phương pháp ít tốn công và hiệu quả về chi phí để theo dõi ở cấp độ đàn, có thể phát hiện DNA của ASFV từ 3-5 ngày sau khi nhiễm, thường là trước khi có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng. Tuy nhiên, nồng độ virus trong dịch miệng thấp hơn trong máu, làm tăng nguy cơ âm tính giả. Tăm bông môi trường có thể phát hiện sự tồn tại của DNA virus nhưng có thể không tương quan với khả năng lây nhiễm.
Bảo quản: Mẫu cần được bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C trong vòng 7 ngày, hoặc đông lạnh ở -20°C hay -80°C nếu cần bảo quản lâu hơn.
2. Tách chiết DNA/RNA
Tùy thuộc vào loại mẫu (ví dụ: mẫu bệnh phẩm từ lợn như máu toàn phần, lách, hạch bạch huyết; hoặc các mẫu môi trường như dịch phết bề mặt,..) và tác nhân gây bệnh là virus Dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) mà cần lựa chọn bộ kit tách chiết DNA cho phù hợp. Lưu ý: Luôn tuân thủ hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất bộ kit.
3. Đọc và phân tích kết quả Real-time PCR
3.1. Tầm quan trọng của các đối chứng trong Real-time PCR
- Đối chứng âm tách chiết (Extraction Negative Control): là mẫu không chứa vật chất di truyền (DNA/RNA) được thực hiện toàn bộ quy trình tách chiết tương tự các mẫu thật nhằm kiểm tra quá trình tách chiết có bị nhiễm chéo hay không.
- Đối chứng âm (Negative Control): là mẫu không chứa trình tự gene mục tiêu trong hỗn hợp phản ứng qPCR, được sử dụng để đảm bảo độ đặc hiệu của mồi sử dụng và xác nhận kết quả chỉ khuếch đại trình tự gene mục tiêu. Nước siêu sạch không chứa DNAse và RNAse (nuclease-free water) được thêm vào hỗn hợp master mix nhằm kiểm tra xem hóa chất và thiết bị có bị ngoại nhiễm trong quá trình nạp mẫu hay từ sản phẩm khuếch đại trước đó hay không.
- Đối chứng dương (Positive Control): là một chất chuẩn (Standard) hoặc là mẫu axit nucleic có số lượng bản sao đã biết trước (Amplicon) giống với trình tự của DNA đích. Kết quả của đối chứng dương luôn dương tính để chứng minh sự hoạt động hiệu quả của PCR mix đang sử dụng, đảm bảo độ nhạy và đặc hiệu của cặp mồi, xác nhận nhiệt độ bắt cặp là chính xác, thời gian kéo dài đủ và không có chất ức chế PCR.
- Chứng nội (Internal Control – IC): là đoạn DNA/RNA được khuếch đại cùng với trình tự mục tiêu trong cùng một phản ứng real-time PCR hoặc trong cùng một lần chạy real-time PCR. Chứng nội thường dùng một đoạn gene không cạnh tranh với gene đích, được đưa vào quá trình tách chiết hoặc pha mix, mục đích để kiểm qua chất lượng phản ứng PCR, kiểm tra sự hiện diện của chất ức chế có trong mẫu.
3.2. Phân tích kết quả Real-time PCR trên ASFV
Khi phân tích kết quả real-time PCR cần đọc kết hợp dữ liệu thô và dữ liệu phân tích là rất quan trọng để đảm bảo độ tin cậy và đánh giá chính xác kết quả, hạn chế các trường hợp âm tính giả, dương tính giả.
- Dữ liệu thô là dữ liệu gốc thu được trực tiếp từ máy real-time PCR trong quá trình chạy phản ứng, trước khi được phần mềm xử lý tự động.
- Dữ liệu phân tích là kết quả đã được phần mềm xử lý từ dữ liệu thô, cho ra các giá trị cụ thể dùng để đánh giá định tính hoặc định lượng.
Bước 1: Kiểm tra hệ thống đối chứng
- Chứng âm tách chiết phải cho kết quả âm tính, đảm bảo hóa chất tách chiết và quá trình thao tác tách chiết không bị ngoại nhiễm.
- Chứng âm PCR phải cho kết quả âm tính, đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng, hóa chất real-time PCR và thiết bị không bị ngoại nhiễm trong quá trình nạp mẫu, hay từ sản phẩm khuếch đại trước đó.
- Chứng dương phải cho kết quả dương tính, đảm bảo các thành phần trong phản ứng real-time PCR và thiết bị hoạt động bình thường.
- Chứng nội IC:
- Thêm vào quá trình tách chiết: Chứng âm tách chiết và các mẫu phải cho kết quả dương tính với chứng nội. Từ đó kiểm tra quá trình tách chiết có thành công hay không, mẫu có chất ức chế phản ứng real-time PCR hay không.
- Thêm vào quá trình nạp mẫu: Chứng âm và các mẫu phải cho kết quả dương tính với chứng nội. Từ đó kiểm tra mẫu có chất ức chế phản ứng real-time PCR hay không.
Bước 2: Thiết lập baseline (đường nền)
- Đường nền (Baseline): là đường biểu diễn mức độ tín hiệu trong suốt những chu kỳ đầu của real-time PCR. Việc thiết lập baseline là bước quan trọng trong phân tích kết quả real-time PCR do baseline không cố định, giá trị baseline sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả cuối cùng. Nếu điều chỉnh giá trị baseline quá thấp, kết quả sẽ rất dễ thu nhận tín hiệu nhiễu (dương tính giả), ngược lại giá trị baseline quá cao, kết quả sẽ có độ chính xác thấp vì bỏ qua các mẫu dương yếu (âm tính giả). Vì vậy, baseline nên được điều chỉnh về khoảng 5% so với giá trị tín hiệu huỳnh quang chứng dương.
- Giá trị ngưỡng cắt (Cut-off): Mỗi xét nghiệm đã được xác thực đều có một giá trị Ct Cut-off được xác định trước để phân biệt kết quả dương tính và âm tính. Ngưỡng này được thiết lập dựa trên Giới hạn phát hiện (LOD) của bộ kit.
Bước 3: Phân tích kết quả
Sau khi điều chỉnh baseline, tiến hành đọc kết quả, ghi nhận giá trị Ct và phân tích kết quả theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit real-time được sử dụng.
- Mẫu âm tính: là mẫu không có đường tín hiệu khuếch đại và không có giá trị Ct ở kênh tác nhân (No Ct: 0.00). Đối với mẫu âm tính, bắt buộc luôn xuất hiện đường tín hiệu khuếch đại ở kênh chứng nội.
- Mẫu Dương tính: là mẫu có đường tín hiệu khuếch đại và có giá trị Ct (giá trị Ct < 35) ở kênh tác nhân. Đối với mẫu dương tính, xuất hiện đường tín hiệu khuếch đại của cả kênh tác nhân và kênh chứng nội. Trong một số trường hợp giá trị Ct của kênh tác nhân lên sớm dẫn đến tín hiệu kênh chứng nội âm tính.
- Không thể kết luận: Đường tín hiệu ở cả kênh tác nhân và kênh chứng nội đều âm tính. Trong trường hợp này, có thể mẫu đang tồn tại chất ức chế, cần pha loãng mẫu 10 lần để tiến hành xét nghiệm lại.
Trong chẩn đoán bệnh trên lợn, kết quả dương tính bằng Real-time PCR với ASFV có thể được phát hiện ngay cả trong giai đoạn ủ bệnh, trước khi lợn biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ rệt. Nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, phương pháp này cho phép xác định sự có mặt của mầm bệnh ở nồng độ thấp, đóng vai trò như một hệ thống cảnh báo sớm cực kỳ giá trị.Việc phát hiện sớm này là yếu tố then chốt, cho phép các cơ quan chức năng và người chăn nuôi triển khai ngay lập tức các biện pháp an toàn sinh học, khoanh vùng, cách ly và xử lý dịch bệnh theo quy định.Do đó, kết quả chẩn đoán bằng Real-time PCR không chỉ đơn thuần xác nhận tình trạng bệnh của một cá thể, mà còn là cơ sở khoa học vững chắc và kịp thời nhằm ngăn chặn sự lây lan của Dịch tả lợn Châu Phi, bảo vệ tổng đàn và giảm thiểu thiệt hại kinh tế ở mức tối đa.
Tài liệu tham khảo
- Hwang, H. J., Choi, Y. S., Song, K., Frant, M., & Kim, J. H. (2023). Development and validation of a fast quantitative real-time PCR assay for the detection of African swine fever virus. Frontiers in Veterinary Science, 9, 1037728.
- Galindo, I., & Alonso, C. (2017). African swine fever virus: a review. Viruses, 9(5), 103.
- Penrith, M. L., Van Emmenes, J., Hakizimana, J. N., Heath, L., Kabuuka, T., Misinzo, G., … & Luka, P. D. (2024). African swine fever diagnosis in Africa: challenges and opportunities. Pathogens, 13(4), 296.
- Chi Cục Thú Y Vùng VI, 2017. Quy trình phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật realtime PCR.
- TCVN 8400-41:2019 về Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán – Phần 41: Bệnh Dịch tả lợn châu Phi.
