Real-time PCR (qPCR) là một kỹ thuật khuếch đại và định lượng DNA nhanh chóng, chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA mục tiêu trong thời gian thực, từ đó cung cấp dữ liệu nhanh chóng và chính xác về số lượng DNA ban đầu trong mẫu. Để đảm bảo kết quả Real-time PCR chính xác và tin cậy, việc sử dụng hệ thống đối chứng là vô cùng cần thiết.
Hệ thống đối chứng gồm chứng âm, chứng dương và chứng nội giúp kiểm soát quy trình từ tách chiết đến phản ứng qPCR, từ đó tránh trường hợp gây sai lệch kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.
1. Đối chứng âm (Negative control)
Đối chứng âm là mẫu không chứa trình tự gene mục tiêu trong hỗn hợp phản ứng qPCR, được sử dụng để đảm bảo độ đặc hiệu của mồi sử dụng và xác nhận kết quả chỉ khuếch đại trình tự gene mục tiêu.
Một số thí nghiệm sử dụng nước là chứng âm bằng cách bổ sung nước cất DNAse-free vào hỗn hợp master mix. Mục tiêu nhằm kiểm tra xem hóa chất và thiết bị có bị ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại trước đó hay không. Kết quả đối chứng âm luôn phải âm tính, tức là không có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích, nhằm chứng minh rằng không có sự khuếch đại không mong muốn xảy ra.
2. Đối chứng dương (Positive control)
Đối chứng dương trong phản ứng qPCR có thể là một chất chuẩn (standard) hoặc là mẫu axit nucleic có số lượng bản sao đã biết trước (Amplicon) giống với trình tự của DNA đích.Kết quả của đối chứng dương luôn dương tính để chứng minh sự hoạt động hiệu quả của PCR mix đang sử dụng, đảm bảo độ nhạy và đặc hiệu của cặp mồi, xác nhận nhiệt độ ủ mồi là chính xác, thời gian kéo dài đủ và không có chất ức chế PCR.
Đối chứng dương có thể tạo ra từ các nguồn khác nhau như đoạn trình tự nhân tạo có kích thước và trình tự tương đồng với DNA mục tiêu, gene chẩn đoán dương tính và xác nhận qua giải trình tự hoặc một plasmid có chứa trình tự mục tiêu. Tuy nhiên, đối chứng dương không thể kiểm tra được quá trình tách chiết có đạt chuẩn hay không.
3. Đối chứng nội (Internal control)
Chứng nội là đoạn DNA được khuếch đại cùng với trình tự mục tiêu trong cùng một phản ứng Real-time PCR hoặc trong cùng một lần chạy Real-time PCR. Chứng nội thường có kích thước khác với sản phẩm khuếch đại để không cạnh tranh với gene mục tiêu và cần có sự khác biệt tối đa 12 chu kỳ khuếch đại với gene mục tiêu (hoặc các gene) trong thí nghiệm, nhờ vậy có thể phân biệt được khi sử dụng đầu dò đặc hiệu.
Hai loại chứng nội tại thường được sử dụng trong các thí nghiệm PCR/Real-time PCR là chứng nội ngoại sinh (Exogeneous controls) và chứng nội nội sinh (Endogeneous control).
► Chứng nội ngoại sinh (Exogeneous controls): thường bao gồm một số lượng bản sao gene mục tiêu được bổ sung vào mẫu thử trước khi tách chiết DNA/RNA. Nếu gene mục tiêu này có nguồn gốc từ DNA đích, có thể sử dụng cùng mồi với DNA đích, tuy nhiên có thể xảy ra nguy cơ cạnh tranh với mồi mục tiêu. Nếu gene bổ sung là DNA có nguồn gốc khác biệt và được khuếch đại song song với DNA đích cần thiết kế mồi/đầu dò đặc hiệu cho DNA chứng nội, đảm bảo nhiệt độ bắt cặp tương tự mồi dành cho DNA đích và tránh tạo ra dimer primer với mồi của DNA đích.
IC ngoại sinh được khuếch đại với kích thước như mong đợi có thể kiểm soát số lượng, chứng minh quá trình tách chiết và hệ thống PCR hoạt động bình thường. Thông thường IC ngoại sinh chỉ được áp dụng cho các mẫu thử sau khi đã được thu thập mẫu, bảo quản và vận chuyển đến phòng thí nghiệm để xử lý. Do đó không thể đánh giá các giai đoạn quan trọng trong quá trình thu nhận và xử lý mẫu.
► Chứng nội nội sinh (Endogeneous control): Thường là gene tham chiếu của vật chủ đã có sẵn trong nền mẫu thử nghiệm. Ví dụ gene β-actin của chim, protein Hydroxym-ethylbilane synthase (HMBS) ở gia cầm, RNAse P gene ở người hay myoglobin gene của tôm sú. Để khuếch đại được IC nội sinh cần thiết kế mồi/đầu dò đặc hiệu cho chứng nội, khác với bộ mồi/đầu dò cho DNA mục tiêu. Điều này giúp kiểm soát số lượng mẫu thử đầu vào, phát hiện chất ức chế trong mẫu và đánh giá toàn bộ quy trình thu mẫu đến tách chiết trong trường hợp mẫu không được lấy đúng cách hoặc không đủ số lượng tế bào.
Tuy nhiên, IC nội sinh có một số nhược điểm như không kiểm soát được nồng độ chứng nội, dùng mồi khác với DNA đích nên không kiểm soát được hệ thống khuếch đại DNA đích. Ngoài ra, IC nội sinh không phân biệt được lỗi xảy ra ở bước nào trong quy trình và đối với mẫu có nhiều vật chủ khác nhau, cần thiết kế nhiều mồi/đầu dò cho từng chứng nội tương ứng.
Hiện nay, các bộ kit do ABT cung cấp bao gồm đầy đủ các thành phần chứng âm, chứng dương và chứng nội giúp kiểm soát chặt chẽ quy trình khuếch đại PCR và Real-time PCR.
Hầu hết các bộ kit của ABT đều sử dụng chứng nội ngoại sinh với hai loại kit: kit có chia sẵn IC và kit không có chia sẵn IC. Đối chứng nội ngoại sinh chỉ phù hợp với kit của ABT và không thể sử dụng cho các kit khác. Riêng đối với xét nghiệm ung thư cổ tử cung (HPV), ABT sử dụng chứng nội sinh là gene RNAse P ở người để kiểm soát quá trình thu mẫu tế bào cổ tử cung, nhằm tránh trường hợp âm tính giả do lấy mẫu không đúng cách.
Tài liệu tham khảo
- Elena Moldovan & Valeriu Moldovan. (2020). Controls in Real-Time Polymerase Chain Reaction Based Techniques, Acta Marisiensis – Seria Medica, 66(3)
- Yaoyao Wang;Jilei Zhang;Kelly Patrick;Min Li;Jiansen Gong;Bu Xu;Qiuping Shen;Yi Yang;Lanjing Wei;Yuanyuan Zhang;Daxin Peng;Jianqiang Ye;Anil Poudel;Chengming Wang; (2020). Hydroxymethylbilane synthase (HMBS) gene-based endogeneous internal control for avian species . AMB Express, (), –. doi:10.1186/s13568-020-01112-5
