Dịch tả lợn châu Phi dần trở thành một đại dịch khác của động vật, ASFV được xem như SAR-CoV-2 trên động vật, tính về mọi mặt. Hiện nay chưa có vaccine đăch hữu điều trị ASFV. Vậy nên, việc phát hiện sớm bệnh là cách duy nhất để kiểm soát thiệt hại. Bài viết sau đây cung cấp 5 loại xét nghiệm ASFV đucợ sử dụng hiện nay để chẩn đoán sớm virus gây bệnh dịch tả heo châu Phi, mời bạn tham khảo.
Tổng quan về ASFV
Dịch tả heo châu Phi (ASF – African Swine Fever) là loại bệnh dễ truyền nhiễm trên heo với tỉ lệ gây tử vong có thể lên đến 100%, gây ra bởi một loại virus DNA mạch kép duy nhất gây bệnh trên heo có cùng tên (ASFV). Tính đến năm 2022, ASFV đã xuất hiện hơn 50 quốc gia và gây ảnh hưởng đến gần 75% nguồn lợn chăn nuôi trên toàn thế giới.
Bệnh dịch tả lợn Châu Phi thường lây lan thông qua vector truyền bệnh là các loại bọ ve mềm hoặc tiếp xúc đường hô hấp và tiêu hóa. Lợn cũng có thể nhiễm bằng các đường khác như vết cắn. Động vật hết bệnh sau khi nhiễm bệnh cấp tính và mãn tính có thể bị nhiễm bệnh trở lại, và trở thành vật mang virus.
Thời gian ủ bệnh của virus dịch tả lợn châu Phi thường giao động từ 4-19 ngày. Các chủng virus độc lực cao gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao 40-41° C, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4-10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên. Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100%. Các dòng virus độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng nhẹ như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi – dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác ở lợn và có thể không nghi ngờ đến ASFV
Bệnh dịch tả lợn châu Phi không lây lan sang người nhưng gây ảnh hưởng rất nặng nề về mặt kinh tế của ngành công nghiệp chăn nuôi. Hiện tại, vaccine ASFV đã và đang được điều chế và phát triển. Tuy nhiên, vẫn chưa có vaccine nào được thương mại hóa chính thức. Vậy nên, dịch tả heo châu phi vẫn còn là một loại dịch bệnh khó phòng ngừa và kiểm soát.
Loại mẫu sử dụng cho xét nghiệm ASFV
Virus dịch tả heo châu Phi xâm nhập và tấn công vào các tế bào leukocytes (monocyte, macrophage) của cơ thể vật nuôi. ASFV theo đường máu di chuyển phát độc lực đến các cơ quan khác trong cơ thể. Vì thế, mẫu xét nghiệm ASFV chứa lượng virus và “dấu chân” nhiều nhất là mẫu máu, các mô hạch bạch huyết và lá lách. Ngoài ra, đối với các phương pháp đặc hiệu hơn như Realtime PCR có thể sử dụng những loại mẫu dịch phết bề mặt dụng cụ, môi trường, dịch phết mũi họng và cả mẫu phân (vì virus có khả năng tồn tại trong phân 11 ngày ở nhiệt độ phòng).
Chú ý đối với mẫu máu chống đông nên sử dụng kim tiêm vô trùng 18G thu mẫu và cho vào ống môi trường vận chuyển có chứa chất chống đông EDTA và lắc nhẹ. Tất cả các loại mẫu phải được bảo quản bằng túi nilon vô trùng và nhiệt độ lạnh (2 °C đến 8 °C). Mẫu cần được vận chuyển đến phòng thí nghiệm nhanh nhất có thể. Mẫu máu, huyết thanh cần được lưu trữ ở nhiệt độ lạnh (2 °C đến 8 °C) tối đa 7 ngày.
Các phương pháp xét nghiệm ASFV
1. Xét nhiệm ASFV phát hiện kháng nguyên
i. PCR và Real-time PCR
Mục đích: PCR và Real-time PCR là phương pháp được sử dụng để phát hiệu vật liệu di truyền của virus trong đa dạng loại mẫu. Phát hiện được sự tồn tại của ASFV trước khi virus gây ra triệu chứng rõ ràng cho vật nuôi
Mẫu: mẫu từ lách, hạch amidan, hạch bạch huyết, huyết thanh và mẫu máu toàn phần thận từ lợn.
Nguyên lý: xét nghiệm ASFV sử dụng primer và probe để bắt cặp đặc hiệu vào trình tự DNA mã hóa cho protein nhận diện đặc thù của ASFV. Hiện nay, các kit chẩn đoán thường thiết kế primers và probes dựa trên vùng trình tự mã hóa protein p72 của ASFV. P72 là protein đặc hiệu của ASFV, có cấu trúc nhận diện tốt kể cả khi mẫu chứa virus bất hoạt hay phân hủy. Bộ kit xét nghiệm ASFV của ABT cũng sử dụng trình tự nhận biết vp72 để phát hiện virus gây bệnh.
Ưu điểm: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phát hiện được virus từ sớm. PCR và Real-time PCR được tổ chức sức khỏa động vật thế giới (OIE) khuyến cáo sử dụng như một phương pháp tiêu chuẩn để chẩn đoán ASFV (https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/)
Nhược điểm: phương pháp xét nghiệm ASFV bằng PCR hoặc Realtime PCR cần có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn để thực hiện các xét nghiệm PCR, giá thành cũng là một vấn đề đối với các nước đang phát triển. Ngoài ra, độ nhạy cao cũng có thể gây nên tình trạng bắt chéo (cross-detection).
ii. Phân lập virus
Mục đích: phân lập virus là một trong những phương pháp lâu đời được sử dụng để phát hiện sự xâm nhập của virus ở lợn. Dựa vào hemadsorption (sự kết dính của virus với tế bào hồng cầu) để quan sát CPE (ly giải tế bào hoặc chết tế bào) của macrophage.
Mẫu: tế bào leukocytes nghi nhiễm ASFV (macrophage hoặc monocyte)
Nguyên lý: tế bào nhiễm ASFV sẽ hình thành gai glycoprotein hemagglutinin ở bề mặt tế bào. Các gai glycoprotein này có khả năng bám dính vào tế bào hồng cầu và hình thành cấu trúc dạng hoa thị. Sau đó quan sát CPE của tế bào macrophage (sau khi Hemadsorption 72 giờ). Vì chỉ có ASFV mới có khả năng chỉ diễn ra quá trình hemadsorption trên lợn.
Ưu điểm: là tiêu chuẩn vàng trong việc xét nghiệm ASFV và phân lập các chủng của chúng. Đồng thời, phân lập virus cũng vừa là phương pháp có thể phân biệt được lợn được tiêm vaccine và lợn nhiễm ASFV.
Nhược điểm: CPE xảy ra sau 72 giờ hemadsorption chắc chắn gây ra bởi ASFV, hiện tượng vẫn CPE xảy ra nhưng không có dấu hiệu của cấu trúc dạng hoa thị nên được chẩn đoán bằng một phương pháp khác. Các nguyên nhân liên đới gây nên hiện tượng này có thể là: ASFV không gây hemadsorption, độc tính quá cao của thành phần chất nuôi cấy, sự xuất hiện của một loại virus khác. Những kết quả âm tính này cần được retest bằng một phương pháp chuẩn xác hơn như PCR và FAT.
iii. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FAT)
Mục đích: phát hiện virus ASF trong mẫu mô lợn bằng kính hiển vi.
Mẫu: sinh thiết mỏng cắt lạnh từ mẫu nội tạng và hạch hoặc vết dịch phết mỏng
Nguyên lí: kháng thể ASFV sẽ được nhỏ lên mẫu đã đặt sẵn trên lam kính. Chất huỳnh quang phát sáng sẽ được quan sát trên kính hiển vi khi có sự bắt cặp giữa kháng thể và kháng nguyên bên trong mô bệnh phẩm.
Ưu điểm: phương pháp xét nghiệm ASFV bằng miễn dịch huỳnh quang có độ đặc hiệu cao. Ngoài ra, FAT được sử dụng trên nền mẫu dịch phết nuôi cấy leukocytes để xác định các chủng ASFV không gây hemadsorption. Đồng thời, FAT cũng phân biệt được CPE được gây ra bởi độc tính của chất nuôi cấy hay sự hoạt động của một loại virus khác.
Nhược điểm: ở thể bán cấp tính và mãn tính, độ nhạy của FAT giảm xuống ~40%.
2. Xét nghiệm kháng thể ASFV
Xét nghiệm ASFV kháng thể xác định được lợn nhiễm bệnh ở thời điểm hiện tại và quá khứ. Tuy nhiên, ở thể trên cấp tính và cấp tính lợn thường chết trước khi kháng nguyên sản sinh đủ để có thể phát hiện. Vì thế, các phương pháp xét nghiệm kháng thể đều được khuyến cáo sử dụng như một tiêu chuẩn để tái khẳng định lại kết quả dương tính ASFV.
i. Phương pháp ELISA xét nghiệm kháng thể
Mục đích: phát hiện sự có mặt của virus thông qua sự xuất hiện của kháng thể ASFV.
Nguyên lí: ELISA kháng thể sử dụng enzyme phát triển màu gắn với kháng thể ASFV. Khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên, enzym phát tín hiệu fluorescent. Từ đó, có thể xác định được sự có mặt của ASFV trong cơ thể. ELISA có nhiều biến thể khác như ELISA trực tiếp, gián tiếp và Sandwich
Ưu điểm: ELISA được sử dụng rộng rãi ở dạng test nhanh, giá thành cạnh tranh hơn rất nhiều so với PCR và cũng không yêu cầu kỹ thuật cao hoặc trang bị thiết bị máy móc phòng thí nghiệm. ELISA cho kết quả nhanh chóng và dễ dàng sử dụng cho quy mô lớn.
Nhược điểm: kết quả chính xác sau khi xuất hiện các dấu hiệu của bệnh từ 7-9 ngày. Hơn nữa, ELISA kháng thể không phân biệt được mẫu bệnh phẩm từ lợn nhiễm bệnh hay lợn tiêm vaccine.
ii. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)
Mục đích: xác định sự có mặt của kháng thể ASFV bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Nguyên lí: các tế bào thận khỉ xanh được cho nhiễm ASFV và xếp thành cấu trúc đơn lớp. Sau đó, ủ lớp tế bào nhiễm virus với mẫu và kháng thể đã được gắn chất huỳnh quang. Kháng thể gắn huỳnh quang phát sáng khi bám và cấu trúc kháng thể (trong mẫu)-kháng nguyên (trong tế bào nhiễm ASFV). Kết quả dương tính sẽ được phát hiện thông qua tín hiệu huỳnh quang trong tế bào chất của tế bào thận khỉ xanh nhiễm ASFV.
Ưu điểm: Cho độ nhạy cao hơn và có thể sử dụng nhiều màu để phát hiện nhiều chủng cùng lúc, chi phí thấp hơn PCR.
Nhược điểm: Xét nghiệm ASFV bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp có thể xảy ra hiện tượng bắt chéo của kháng thể. Kháng thể huỳnh quang có thể phản ứng với globulin miễn dịch nội sinh
