Trong lĩnh vực sinh học phẩn tử, việc khuếch đại một đoạn vật chất di truyền lên gấp nhiều lần sẽ giúp dễ dàng phát hiện được sự tồn tại của các thực thể mang vật chất di truyền đó. Khuếch đại chia làm hai nguyên lý chính: khuếch đại luân nhiệt và khuếch đại đẳng nhiệt. Bênh cạnh những phương pháp khuếch đại luân nhiệt phổ biến hiện nay như PCR, trong chuỗi bài viết này, chúng tôi sẽ giới thiệu lần lượt các phương pháp phổ biến của khuếch đại đẳng nhiệt và những ứng dụng, bắt đầu là kỹ thuật (RPA)
Giới thiệu kỹ thuật khuếch đại gene
Gene là các đoạn chứa các phân tử nucleic acid chứa thông tin di truyền cần thiết đặc trưng cho sự hình thành, phát triển và hoạt động của một cá thể. Về kích thước, hệ gene nằm trong tế bào với kích thước siêu nhỏ tính bằng µm nhưng chiều dài có thể lên đến hàng tỷ km. Vì vậy việc nghiên cứu một trình tự nhất định có chiều dài khoảng vài trăm đến vài ngàn trong hệ gen là rất khó. Các phương pháp nhân bản gene được ra đời để giải quyết vấn đề này, trong đó bao gồm hai phương pháp khuếch đại luân nhiệt và khuếch đại đẳng nhiệt.
Phương pháp luân nhiệt được biết đến là PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR hiện được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán tác nhâ ở nhiều đối tượng khác nhau. Một số kỹ thuật khác được cải tiến từ PCR truyền thống như real-time PCR, Reverse-transcriptase PCR, hot-start PCR, … được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Tuy nhiên, PCR và các kỹ thuật luân nhiệt đều có điểm chung là phải có máy chỉnh nhiệt đắt tiền, hệ thống phòng thí nghiệm, yêu cầu mẫu đầu vào phải được tinh sạch và phân tích kết quả qua nhiều bước.
Trong khi đó, các phương pháp đẳng nhiệt đã ra đời với việc thực hiện phản ứng nhân bản gene mục tiêu ở một nhiệt độ mà không cần dùng máy luân nhiệt. Một số kỹ thuật như RPA, LAMP, HDA, … đã cho thấy những ưu điểm của phương pháp đẳng nhiệt so với luân nhiệt.
Trong đó cụ thể RPA là kỹ thuật có điểm mạnh nổi trội khi có thể thực hiện ngoài thực địa do phản ứng khuếch đại gene xảy ra ở nhiệt độ phòng hay môi trường, chi phí thấp, thời gian phản ứng và đọc kết quả nhanh chóng. Mặc dù độ phủ về ứng dụng thực tế của RPA chưa rộng và phổ biến như PCR hay real-time PCR nhưng kỹ thuật này mang nhiều tiềm năng và có triển vọng đặc biệt là trong chẩn đoán nhanh các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở ngay tại nơi phát hiện nhằm hạn chế sự lây lan thành dịch bệnh.
(nguồn: https://www.goldbio.com)
Kỹ thuật Recombinase polymerase amplification (RPA)
Recombinase polymerase amplification (RPA)- là kỹ thuật sử dụng recombinase và protein SSB (single-stranded DNA binding) để tách mạch đôi DNA thay thế cho bước biến tính dùng nhiệt trong PCR, sau đó kết hợp hoạt tính DNA polymerase để tổng hợp gene.
Cụ thể, phản ứng của RPA bắt đầu hình thành phức hợp nucleoprotein giữa recombinase và mồi. Phức hợp này sẽ trượt và tìm kiếm đoạn trình tự tương đồng trên sợi DNA mạch đôi, sau đó hình thành cấu trúc D-loop, lúc này protein SSB sẽ bám và ổn định cấu trúc mở mạch đôi. Cuối cùng, DNA polymerase sẽ bắt đầu tổng hợp sản phẩm từ vị trí mồi bắt cặp. Kết quả RPA được kiểm tra bằng nhiều cách bao gồm điện di, que giấy và probe gắn huỳnh quang (dùng máy real-time để đọc kết quả), tùy thuộc vào mục đích khuếch đại gene mà sử dụng phương pháp phù hợp [1].
Nghiên cứu cho thấy ngưỡng phát hiện gene của RPA có thể đạt 1 copy DNA mục tiêu (hoặc <10 bản copy RNA) mà không yêu cầu cao về độ tinh sạch của mẫu đầu vào, có thể dùng trực tiếp mẫu mô hay nhựa lá [2,3]. Thời gian RPA chỉ khoảng 10-20 phút, toàn bộ phản ứng xảy ra ở nhiệt độ khoảng 37 0C – 42 0C [4]. Cùng với đó, que giấy cũng là phương pháp được kết hợp khi làm RPA0 thực địa, dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch sử dụng kháng thể đầu hạt vàng và ligand biotin để gắn lần lượt tương ứng với gene mục tiêu có đầu FAM và biotin.
Kết quả có thể đọc nhanh bằng mắt thường, nếu dương tính thì que giấy sẽ xuất hiện 2 vạch và âm tính là một vạch. Trong khi hai phương pháp điện di và dùng probe yêu cầu nhiều thiết bị phòng thí nghiệm đi kèm như bộ điện di, đèn UV hay máy real-time. Ngoài những ưu điểm về thực hiện phản ứng và đọc kết quả, các thành phần RPA thường được trữ ở dạng đông khô, tiện lợi cho việc sử dụng vận chuyển và bảo quản. Những điều này giúp RPA có khả năng trở thành phương pháp được lựa chọn hàng đầu khi tiến hành phản ứng tại nơi lấy mẫu.
Hầu hết các kit thương mại hiện nay đều sử dụng recombinase RecA từ và Sau DNA polymerase từ Staphylococcus aureus. Bên cạnh đó, protein T4 UvsY hỗ trợ sự hình thành phức hợp nucleoprotein, polyethylene glycol là dung môi nhằm tăng cường khả năng tương tác giữa các thành phần phản ứng với phân tử ADN. Enzyme creatine kinase xúc tác quá trình tạo ATP từ phosphocreatine để cung cấp năng lượng cho hoạt động của các enzyme khác. Đến nay, một số hợp chất cần thiết cũng được bổ sung vào kit nhằm tối ưu hóa tính đặc hiệu và khả năng nhân đoạn trình tự mục tiêu của phản ứng RPA.
Nghiên cứu và ứng dụng RPA
Trên thế giới hiện nay, các công bố về ứng dụng RPA cũng đã được ghi nhận. Theo đó, nhà virus học Ahmed Abd El Wahed đã chế tạo ra chiếc vali nhỏ gọn chứa toàn bộ những thứ cần thiết cho RPA để phân tích DNA của virus Ebola ngay tại chỗ [5]. Kỹ thuật này đã khuếch đại DNA mục tiêu chỉ trong vòng mười phút, hoạt động ở nhiệt độ 37 0C và không cần làm thiết bị mát trong quá trình vận chuyển. Bên cạnh đó, RPA có thể kiểm tra các mẫu máu của 8 loại virus khác nhau từ 3 dòng Ebola – điều mà các kit test nhanh không đáp ứng được.
Ngoài ra, một số tác nhân khác như virus ASF gây dịch tả lợn châu Phi hay Adenovirus gây nhiều bệnh lý ở người cũng đã ghi nhận có thể phát hiện bằng RPA [6,7]. Các nghiên cứu mới đây cũng đã ứng dụng RPA trong chẩn đoán nhanh SARS-CoV-2 như sử dụng hệ thống vi giọt [8] hay khẩu trang phát hiện SARS-CoV-2 bằng công nghệ RT-RPA kết hợp CRISPR-Cas12a [9].
Như vậy, RPA hiện đang được nghiên cứu nhiều trong sàng lọc nhanh chóng và hạn chế sự lây lan nhanh chóng của tác nhân gây bệnh, đặc biệt là bệnh truyền nhiểm do virus. Mặc dù vậy, bên cạnh những ưu điểm, RPA cũng có mặt hạn chế, vì sử dụng một nhiệt độ cho phản ứng nên rất khó tối ưu phản ứng và khó kiểm soát các sản phẩm không đặc hiệu. Do vậy, kỹ thuật real-time PCR hay PCR cải tiến khác như digital PCR vẫn đang chiếm ưu thế và được sử dụng phổ biến, đặc biệt là trong chẩn đoán hay định lượng tác nhân gây bệnh.
Ở Việt Nam, RPA chưa phổ biến. Hầu hết, việc chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân gây bệnh hiện nay vẫn sử dụng kit real-time PCR. RPA mới chỉ được nghiên cứu trên một số loài như Listeria monocytogenes gây ngộ độc thực phẩm [10] hay Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax gây bệnh sốt rét [11]. Dù vậy, với nhiều ưu điểm phù hợp ứng dụng ở thực địa, kỹ thuật RPA vẫn đầy triển vọng có thể trở thành một trong những phương pháp chẩn đoán các tác nhân gây bệnh một cách hiệu quả trong thời gian tới.
