Định tuýp HPV bằng kỹ thuật xét nghiệm Reverse Dot Blot (RDB)

Table of Contents

Ước tính mỗi người phụ nữ sẽ mắc phải ít nhất 1 loại HPV trong đời. Tuy nhiên, không phải loại HPV nào cũng gây bệnh và không phải loại HPV gây bệnh nào cũng có thể dẫn đến ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm tầm soát virus HPV, sàng lọc ung thư cổ tử cung giúp giảm tới 70% tỉ lệ mắc phải. Bằng phương pháp reverse dot blot, ABT mang đến một giải pháp sàng lọc định tuýp HPV hiệu quả hỗ trợ đắc lực cho việc xác định và điều trị, có thể phát hiện cùng lúc lên đến 35 tuýp HPV đặc hữu và phổ biến ở khu vực châu Á.

Tổng quan về HPV

Virus HPV hay còn được gọi với tên La Tinh là Human Papilomavirus, là một virus thuộc họ Papovaviridae, lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất có thể gây ra một số bệnh ung thư và mụn cóc sinh dục. Khoảng 80% đàn ông và phụ nữ có hoạt động tình dục bị nhiễm HPV vào một thời điểm nào đó trong đời và hầu hết các ca nhiễm mới là ở những người ở độ tuổi thanh thiếu niên và những năm 20 tuổi đầu. Hầu hết người bệnh sẽ không có triệu chứng và có thể không bao giờ biết họ có virus, nhưng trong khi bị nhiễm virus có thể lây lan.

Bộ gen của papillomavirus là một phân tử DNA hình tròn sợi đôi có chiều dài xấp xỉ 8.000 bp. Nó không có lớp màng lipid bao bọc và được cấu tạo từ 1 protein duy nhất tên là L1, đóng vai trò hình thành vỏ capsid dày 55-60 nm gồm 72 capsomer hình ngôi sao. Lớp vỏ L1 cùng với các protein histone của tế bào, dùng để bao bọc và cô đặc DNA.

Một số thông tin thêm về HPV:

  • HPV phổ biến đến mức khoảng 4/5 người chưa được tiêm phòng sẽ bị nhiễm HPV vào một thời điểm nào đó trong đời.
  • Trước khi vắc-xin HPV được giới thiệu, khoảng 340.000 đến 360.000 phụ nữ và nam giới bị ảnh hưởng bởi mụn cóc sinh dục do HPV gây ra mỗi năm
  • Hàng năm, khoảng 11.000 phụ nữ sống ở Mỹ sẽ được chẩn đoán và hơn 4.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung. Khoảng 21.000 phụ nữ và 15.000 nam giới bị ảnh hưởng hàng năm bởi các bệnh ung thư do HPV gây ra.
  • Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ước tính có 43 triệu ca nhiễm HPV ở Hoa Kỳ vào năm 2018, bao gồm 13 triệu ca nhiễm mới

Chẩn đoán và sàng lọc HPV

Các biện pháp khám sàng lọc phổ biến nhất hiện nay là

  • Xét nghiệm tế bào học (Pap smear)
  • Quan sát tế bào ung thư cổ tử cung bằng phương pháp nhuộm (LBC)
  • Xét nghiệm HPV-DNA

Bệnh nhân nếu muốn xét nghiệm sàng lọc để phát hiện sớm ung thư cổ tử cung thì nên chọn HPV-DNA, vì phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời có thể định type để biết hướng điều trị, bệnh nhân không phải lấy mẫu lại nhiều lần. Hiện tại ABT có cung cấp bộ kit TopSENSI® HPV qPCR KIT (SQH-103) cho các xét nghiệm HPV-DNA bằng kĩ thuật Realtime PCR cho kết quả chính xác, nhanh chóng.

HPV có bao nhiêu loại ?

Hiện nay có hơn 150 type HPV, trong đó 40 type ảnh hưởng đến vùng sinh dục, nhưng hầu hết không gây nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe. Một người có thể bị nhiễm nhiều hơn một type HPV cùng một lúc. Các type được xác định theo số lượng và thuộc một trong hai loại sau.

Low-risk HPV

Hầu hết các type HPV sinh dục nguy cơ thấp không gây ra các triệu chứng và biến mất khi cơ thể hình thành khả năng miễn dịch với virus. Những type này không liên quan đến ung thư nhưng có thể dẫn đến mụn cóc sinh dục. Ngoài âm hộ và dương vật, mụn cóc có thể xuất hiện trên cổ tử cung hoặc âm đạo ở phụ nữ, bìu ở nam giới hoặc trong và xung quanh hậu môn ở nam giới hoặc phụ nữ. Mụn cóc cũng có thể xuất hiện trong miệng và cổ họng.

Hai type HPV, loại 6 và 11, gây ra 90% các mụn cóc này. Chỉ có khoảng 1% người Mỹ có hoạt động tình dục có mụn cóc sinh dục đáng chú ý, cần điều trị để ngăn ngừa lây lan sang các vùng sinh dục khác và cho bạn tình. Một số type HPV nguy cơ thấp có thể gây ra chứng loạn sản cổ tử cung nhẹ, những thay đổi bất thường trong các tế bào trên bề mặt cổ tử cung. Những thay đổi này không phải là tiền ung thư.

High-risk HPV

Nhiễm HPV nguy cơ cao có thể dẫn đến chứng loạn sản cổ tử cung lan rộng hơn và một số loại ung thư. Có ít nhất 12 type HPV có nguy cơ cao, nhưng chỉ có hai loại—loại 16 và 18—gây ra phần lớn các bệnh ung thư liên quan đến HPV, bao gồm những bệnh liên quan đến cổ tử cung, âm đạo, âm hộ, dương vật và hậu môn.

Các type HPV nguy cơ cao cũng có thể dẫn đến ung thư cổ họng, lưỡi và amidan, được gọi là ung thư hầu họng. Các nhà nghiên cứu tin rằng nhiễm trùng HPV ở miệng và cổ họng có thể do quan hệ tình dục bằng miệng với người đang bị nhiễm trùng nguy cơ cao. Tuy nhiên, điều quan trọng cần nhớ là đối với hầu hết mọi người, hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ virus HPV khỏi cơ thể trong vòng hai năm. Mặc dù nhiễm các type HPV nguy cơ cao có thể gây ung thư, nhưng hầu hết những người bị nhiễm các type này không phát triển thành ung thư.

RDB là gì?

Reverse Dot Blot (RDB), tiếng Việt là lai điểm ngược là một kĩ thuật trong đó các đầu dò (probe) oligonucleotide đặc hiệu của allele hoặc gene mục tiêu được gắn với màng lai thay vì sản phẩm PCR và DNA khuếch đại được đánh dấu trong quá trình PCR được sử dụng để lai với dãy probe cố định.

sơ đồ lai rdb
Hình 1. Sơ đồ của RDB. Sản phẩm PCR đánh dấu biotin được lai với allele-specific oligonucleotide (ASO) probe. Probe được liên kết với màng nylon bằng liên kết chéo poly(dT) và UV hoặc bằng liên kết cộng hóa trị với các trình tự liên kết amino. Các thể lai có thể được phát hiện bằng phản ứng của một cơ chất không màu với HRP (horseradish peroxidase) để tạo thành kết tủa có màu. (Nguồn)  

Định tuýp HPV bằng RDB

Phương pháp lai điểm ngược (reverse dot-blot) là một quy trình chẩn đoán đơn giản và nhanh chóng, cho phép sàng lọc mẫu để tìm nhiều loại đột biến/đa hình trong một phản ứng lai đơn. Một số phương pháp cố định các mẫu dò oligonucleotide đã được đưa ra.

Phương pháp lai điểm ngược có một số đặc tính độc đáo có giá trị trong việc thiết lập chẩn đoán:

(1) nhiều kết quả định type từ một mẫu đơn lẻ có thể được hiện diện trên một màng lai. Điều này giúp cho hoạt động trượt và tìm kiếm trình tự của đầu dò thuận lợi và giảm thiểu khả năng xảy ra lỗi của kỹ thuật viên.

(2) Có sẵn màng lai cho định type. Điều này giảm thiểu thao tác thủ công của kỹ thuật viên cũng như khả năng xảy ra lỗi và có thể dùng chất chuẩn.

(3) Không giống như định type bằng dot-blot/oligonucleotide, chỉ sản phẩm PCR được gắn biotin mới xảy ra phản ứng lai, do đó loại bỏ vấn đề tiềm ẩn của các probe gắn biotin không đặc hiệu. Phương pháp này đã được sử dụng trong các lĩnh vực xác định gene pháp y (xét nghiệm HLA-DQα Amplitype), xác định loại mô để cấy ghép (xét nghiệm HLA-DRβ), sàng lọc xơ nang, cũng như trong nhiều nghiên cứu ứng dụng khác nhau.

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến của 1 loại bệnh như β-thalassemia, đột biến kháng thuốc lao, định type HPV, …  Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm xác định sự đồng nhiễm của 32 type HPV phổ biến tại việt Nam (Human papillomavirus). Trong đó bao gồm:

Bộ kit có khả năng nhận diện 35 genotype HPV bao gồm:

12 genotype HPV nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59.

10 genotype HPV có khả năng nguy cơ cao: 26, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82.

13 genotype HPV nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 64, 71, 72, 81, 83. Thành phần và vai trò của hóa chất trong bộ kit TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT:

RBD1NaOHSử dụng để làm biến tính DNA pH [25-29]. Ở pH kiềm, các nhóm OH- chiếm ưu thế. Chúng loại bỏ các proton tạo ra liên kết hydro khỏi guanin và thymine, do đó phá vỡ các liên kết hydro giữa hai oligonucleotide.
 RBD6RDB2: 0.15 M NaCl và 0.015 M sodium citrateTạo môi trường ion phù hợp cho phản ứng lai.
 RBD6RBD3: 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).Kết tủa trong điều kiện lạnh cần phải rã đông trước khi sử dụng. SDS khiến mạch DNA đơn duỗi ra làm giảm cấu trúc bậc 2 để đoạn gen dễ dàng lai vào mẫu dò.
 RBD6Nước cất 2 lần.Tạo môi trường thích hợp để đoạn gen đích lai với mẫu dò đã được cố định trên màng lai đồng thời rửa trôi các liên kết không đặc hiệu.
RDB4  Streptavidin-HRP–         Streptavidin có ái lực cao với phân tử biotin. Streptavidin HRP là một cộng hợp protein streptavidin liên hợp với HRP. –         HRP là 1 peroxidase enzyme. Tùy thuộc vào cơ chất mà phản ứng giữa enzyme HRP và cơ chất sẽ tạo ra màu sắc khác nhau.
RBD5  –         Tris-HCl 0,1M pH 9,5 –         NaCl –         MgCl2–         Là môi trường thích hợp để phản ứng hiện màu diễn ra. –         Đảm bảo pH thích hợp và cung cấp cofactor Mg+ cho enzyme hoạt động.
TMB –         TMB là cơ chất của Streptavidin-HRP. Khi TMB liên kết với Streptavidin-HRP sẽ tạo ra phản ứng màu xanh. –         TMB rất nhạy cảm với ánh sáng do đó cần tránh ánh sáng khi thực hiện thao tác với TMB. –         Không để nắp chai bảo quản mở trong thời gian kéo dài vì TMB nhạy cảm với các tác nhân oxi hóa. –         TMB bị đông đá trong điều kiện lạnh. Cần chú ý rã đông hoàn toàn trước khi hút.

Một số hình ảnh kết quả thực tế khi lai RDB bằng bộ kit TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT:

kết quả lai định tuýp hpv
kết quả lai định tuýp hpv
kết quả lai định tuýp hpv

Bước đọc kết quả có thể sẽ gặp các sự cố, và cách xử lý những sự cố có thể xảy ra như:

Sự cốNguyên nhânKhắc phục
Hình kết quả định type mờ1. Mẫu dương yếuXử lý tăng nồng độ virus trong mẫu
 2.Hiệu quả của bước biến tính không tốt, dẫn đến sản phẩm PCR không bắt được với probe trên màng lai.Kiểm tra lại qui trình và hóa chất biến tính sản phẩm PCR, đảm bảo thực hiện đúng theo hướng dẫn sử dụng.
Mẫu âm tính với tất cả 35 genotype, kể cả chứng dương mặc dù kết quả realtime PCR dương tính với HPV.1.Mẫu thực sự âm tính với HPVKiểm tra lại xem mẫu có thực sự dương tính với HPV hay không.
 2.Thực hiện không đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Kiểm tra lại việc thực hiện toàn bộ qui trình.
 3. Hóa chất hỏng do hết hạn sử dụng hoặc do không bảo quản đúng qui định.Kiểm tra lại điều kiện bảo quản, HSD và hiệu quả của các thành phần.

Bài viết liên quan

gbs

GBS VÀ NGUYÊN NHÂN PHẢI SÀNG LỌC TRƯỚC SINH

“Mẹ tròn con vuông” là câu chúc với mong ước sức khỏe của người mẹ và bé được đảm bảo. Giai đoạn sinh con có nhiều yếu tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe và thậm chí là tính mạng của mẹ và bé. Việc kiểm tra sức khỏe thai phụ trước sinh là điều rất cần thiết nhằm phát hiện và can thiệp kịp thời các tác nhân gây ảnh hưởng sức khỏe, tính. Liên cầu khuẩn Group B streptococcus (GBS) là một loại vi khuẩn vô hại cho những người mang, nhưng nếu không điều trị, nó có thể được truyền cho em bé trong khi sinh con và gây ra những hậu quả nghiêm trọng.

Read More »
định tuýp hpv

Định tuýp HPV bằng kỹ thuật xét nghiệm Reverse Dot Blot (RDB)

Ước tính mỗi người phụ nữ sẽ mắc phải ít nhất 1 loại HPV trong đời. Tuy nhiên, không phải loại HPV nào cũng gây bệnh và không phải loại HPV gây bệnh nào cũng có thể dẫn đến ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm tầm soát virus HPV, sàng lọc ung thư cổ tử cung giúp giảm tới 70% tỉ lệ mắc phải. Bằng phương pháp reverse dot blot, ABT mang đến một giải pháp sàng lọc định tuýp HPV hiệu quả hỗ trợ đắc lực cho việc xác định và điều trị, có thể phát hiện cùng lúc lên đến 35 tuýp HPV đặc hữu và phổ biến ở khu vực châu Á.

Read More »
nested pcr

Nested PCR – Kỹ thuật PCR nâng cao và 3 điều cần phải biết

PCR là một kỹ thuật được phát triển vào những năm 1970, mục tiêu chủ yếu là nhân bản DNA mục tiêu thành nhiều các bản sao. Trong vài thập kỷ qua, PCR truyền thống đã được cải tiến thành các loại kỹ thuật đa dạng, hiện nay có hơn 30 biến thể của kỹ thuật PCR (Rajalakshmi, 2017). Trong đó, nested PCR là một trong kỹ thuật biến thể có khả năng gia tăng tính đặc hiệu của phản ứng.

Read More »
RPA

RPA – nguyên lý và ứng dụng

Trong lĩnh vực sinh học phẩn tử, việc khuếch đại một đoạn vật chất di truyền lên gấp nhiều lần sẽ giúp dễ dàng phát hiện được sự tồn tại của các thực thể mang vật chất di truyền đó. Khuếch đại chia làm hai nguyên lý chính: khuếch đại luân nhiệt và khuếch đại

Read More »
IHHNV

IHHNV – virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus – IHHNV) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do tác nhân Virus IHHNV gây ra. Đây là một virus thuộc họ Parvoviridae, có cấu trúc di truyền là phân tử DNA mạch đơn (ssDNA). Kích thước bộ gen khoảng 3,9 kb

Read More »
tách chiết DNA/RNA

Tách chiết DNA/RNA sử dụng phương pháp cột silica và từ tính

Tách chiết DNA/RNA là phương pháp cơ bản được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử nhằm thu nhận DNA, RNA tinh sạch. Quá trình này được xem là điểm khởi đầu quan trọng cho nhiều ứng dụng từ nghiên cứu cơ bản đến việc phát triển các phương pháp sàng lọc trong chẩn đoán, điều trị bệnh. Phương pháp tách chiết đã ứng dụng để hỗ trợ cho nhiều kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự bộ gen, phát hiện vi khuẩn và virus trong môi trường và xác định quan hệ huyết thống, …

Read More »

Công ty TNHH giải pháp y sinh ABT

ABT là một trong những công ty công nghệ sinh học hàng đầu, chuyên cung cấp các giải pháp hỗ trợ trong lĩnh vực chẩn đoán sinh học phân tử. Đồng thời, chúng tôi cũng là một cầu nối đưa các thành tựu nghiên cứu sinh học áp dụng gần hơn vào thực tiễn, đặc biệt trong việc ngăn chặn đại dịch Covid-19

liên hệ với chúng tôi

Xưởng 5.02 - 6.07 , Lô L2, Đường Long Hậu - Hiệp Phước, KCN Long Hậu, X. Long Hậu, H. Cần Giuộc, Tỉnh Long An.

Số 9, Đường 17B, Phường Bình Trị Đông B, Quận Bình Tân, TP.HCM

0903 307 258
028 2216 0885

sales@abtvn.com

Scroll to Top
Scroll to Top