1. Oligonucleotide là gì?
Oligonucleotides (hay Oligos) là những phân tử DNA hoặc RNA ngắn, được tạo thành từ sự kết nối của nhiều tiểu phân tử nucleotide, liên kết với nhau để tạo thành các polyme sinh học chuỗi đơn. Các đơn phân trong quá trình tổng hợp Oligo là các nucleoside phosphoramidite. Phosphoramidite có bản chất là các nucleoside nhưng được biến đổi bởi vì một nucleoside trong tự nhiên mang rất nhiều nhóm hydroxyl (OH) và nhóm amino (NH2), cả hai nhóm này đều có thể dễ dàng tương tác với nhiều hợp chất khác được sử dụng trong quá trình tổng hợp DNA.
Một phân tử phosphoramidite tiêu chuẩn chứa phosphit thay vì nhóm phosphat trong nucleotide, kèm theo đó là 4 nhóm bảo vệ bao gồm: nhóm bảo vệ Dimethoxytrityl (DMT), Diisopropylamino, 2-cyanoethyl và nhóm biển đổi có chức năng bảo vệ các nhóm amino của bazơ.
Công dụng phổ biến nhất của Oligos dùng như các đầu dò phân tử hoặc đoạn mồi (primer) cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) nhằm khuếch đại số lượng DNA từ mẫu gốc. Các ứng dụng của đoạn mồi oligo bao gồm giải trình tự DNA, biểu hiện gen, nhân bản và chẩn đoán phân tử. Ở vai trò đầu dò, Oligos được dùng trong các quy trình blotting như southern blotting, northern blotting nhằm sàng lọc các bệnh di truyền hoặc xác định các mầm bệnh cụ thể trong chẩn đoán sinh học phân tử. Ngoài ra, oligo được đang được nghiên cứu phân tử trong điều trị, ức chế gen hay ứng dụng nucleotide tổng hợp trong tương lai.
Tổng hợp oligonucleotide được thực hiện trên giá đỡ rắn (còn được gọi là resin) thường có đường kính 50-200 μm. Nhiều loại giá đỡ rắn đã được sử dụng, nhưng CPG (controlled pore glass) và polystyrene đã được chứng minh là hữu ích nhất.
2. Quy trình tổng hợp Oligonucleotide
Quá trình tổng hợp Oligonucleotide sử dụng phosphoramidite có thể được tiến hành trong dung dịch hoặc trên pha rắn. Các trình tự oligonucleotide có thể được lắp rắp từng bước theo chiều từ 3’ đến 5’ (ngược lại với chiều tổng hợp DNA trong quá trình sao chép DNA) bằng cách lặp lại các chu kỳ tổng hợp. Mỗi chu trình tổng hợp bao gồm bốn bước là bốn phản ứng hóa học bao gồm: khử DMT (Deblocking), ghép nối (Coupling), khóa (Capping) và oxy hóa (Oxidation).
Bước 1: Khử DMT (Detritylation)
Nhóm bảo vệ DMT (4,4′-dimethoxytrityl) ở đầu 5’ của chuỗi DNA liên kết với resin phải được loại bỏ để giải phóng nhóm 5’-OH nhằm ghép nối với phosphoramidite tiếp theo. Quá trình loại bỏ nhóm bảo vệ DMT này có thể được loại bỏ dưới điều kiện axit, chẳng hạn như dung dịch axit Trichloroacetic Acid (TCA) 3% hoặc Dichloroacetic Acid (DCA) 3%.
Bước 2: Ghép nối (Coupling)
Sau quá trình khử trityl, phosphoramidite đã khử DMT sẵn sàng phản ứng với base tiếp theo, được thêm vào dưới dạng đơn phân monome nucleoside phosphoramidite. Một lượng nucleoside phosphoramidite được trộn với các dung dịch ghép nối (chất hoạt hóa – Activator solution) như 1H-tetrazole, được hòa tan trong dung môi acetonitrile. Nhóm amino của nucleoside phosphoramidite được proton hóa và sau đó nhanh chóng được thay thế bằng nhóm 5′-hydroxyl (5’OH) của phosphoramidite và một liên kết của triester phosphite với giá thể được hình thành.
Bước 3: Khóa (Capping)
Không phải lúc nào hiệu suất trong mỗi bước ghép nối cũng đạt được ngưỡng lý tưởng 100%, vẫn còn một vài nhóm 5′-hydroxyl chưa phản ứng trên nucleotide liên kết với resin.
Vì thế, nếu không được kiểm tra loại bỏ, các nhóm 5′-hydroxyl này sẽ sẵn sàng để tham gia vào bước ghép nối tiếp theo. Để ngăn chặn điều này, bước “capping” được thực hiện sau phản ứng ghép nối giúp khóa và ngăn chặn các nhóm 5′-hydroxyl chưa phản ứng bằng cách sử dụng hai dung dịch Capping: acetic anhydride và N-methylimidazole (NMI). Hai dung dịch này được hòa tan trong tetrahydrofuran hoặc acetonitril (Capping A) được trộn với dung dịch N-methylimidazole (Capping B) có tác dụng xúc tác. Các nhóm hydroxyl tự do được chuyển đổi thành axetat và bị khóa lại, ngăn chặn sự khử trityl và ngăn sự kéo dài chuỗi tiếp theo cũng như hình thành các oligonucleotide dài với trình tự không chính xác.
Bước 4: Oxi hóa (Oxidation)
Liên kết Phosphite-triester (P(III)) được hình thành trong bước ghép nối không bền với axit và phải được chuyển đổi thành dạng hóa trị năm (V) ổn định trước khi bước qua quá trình khử DMT tiếp theo. Điều này đạt được bằng cách oxy hóa iốt với sự có mặt của nước và pyridin. Ở bước này, nhóm bảo vệ cyanoethyl ngăn chặn các phản ứng không mong muốn với phosphorus trong các chu kỳ tổng hợp tiếp theo. Chu kỳ được lặp lại, một lần đối với mỗi base, để tạo ra oligonucleotide cần thiết.
Sau khi hoàn thành quá trình tổng hợp chuỗi, quá trình cắt oligonucleotide khỏi giá thể rắn và khử bảo vệ sẽ giúp kết thúc quá trình tổng hợp Oligonucleotide thô (chưa được tinh sạch). Amonium hydroxide được dùng trong quá trình cắt và khử bảo vệ tiêu chuẩn. Hóa chất AMA (hỗn hợp 1:1 giữa metylamin và amonium hydroxide) và phosphoramidite ultramild trong Capping A được dùng tương ứng với trong quá trình cắt và khử bảo vệ nhanh (fast) và nhẹ (mild).
Sau khi hoàn thành bước cắt và khử bảo vệ, oligo được tinh sạch bằng các phương pháp khác nhau tùy thuộc vào chiều dài, ứng dụng, chi phí, v.v. Một số phương pháp tinh sạch phổ biến như: khử muối, cartridge (DMT-ON), RP-HPLC, v.v.
Trong đó, OligoX – Dịch vụ tổng hợp Oligonucleotides của ABT lựa chọn 2 phương pháp khử muối, cartridge (DMT-ON) nhằm tối ưu độ tinh sạch của sản phẩm và chi phí đối với khách hàng.
3. Điều kiện bắt buộc trong tổng hợp Oligonucleotides
Trong quá trình tổng hợp Oligo, trình tự nucleotide càng dài và càng phức tạp thì càng khó đáp ứng các mục tiêu về chất lượng, độ tinh sạch và chi phí. Việc đảm bảo các yêu cầu về kiểm soát nhiệt độ, pH, độ ẩm, các chất có khả năng gây nhiễm hay bụi mịn rất quan trọng, đóng vai trò trong việc đáp ứng các yêu cầu trên.
Nhiệt độ, độ ẩm:
Độ ẩm có thể tác động đến tốc độ và hiệu suất của các phản ứng hóa học trong quá trình tổng hợp oligonucleotide. Trong quá trình tổng hợp, có thể xuất hiện các sản phẩm phụ hoặc chất cặn không mong muốn. Độ ẩm có thể ảnh hưởng đến sự tạo thành của những impurities này. Sự thiếu hụt hoặc quá nhiều độ ẩm đều có thể gây phá vỡ hoặc làm mất tính chất của oligonucleotide đã tổng hợp.
Độ pH:
Độ pH ảnh hưởng đến tốc độ của các phản ứng hóa học trong quá trình tổng hợp. Nhiều phản ứng tổng hợp oligonucleotide cần môi trường, dung môi có độ pH cụ thể để diễn ra hiệu quả. Điều này bao gồm cả các bước liên quan đến phản ứng ghép nối, cắt và khử bảo vệ và các bước xử lý khác.
Bụi mịn và chất gây nhiễm (contaminant)
Bụi mịn và chất có khả năng gây nhiễm có thể chứa các tác nhân nhiễm độc hoặc enzyme ngoại lai có thể làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp. Nếu chúng tiếp xúc với mẫu oligonucleotide hoặc các dụng cụ trong phòng thí nghiệm, chúng có thể gây nhiễm bẩn cho sản phẩm cuối cùng và tạo ra các phản ứng không mong muốn.
Vì vậy, các điều kiện về độ ẩm, độ pH, chất có khả năng gây nhiễm v.v luôn được kiểm soát nghiêm ngặt và cần được thao tác trong Tủ An toàn Sinh học trong các bước hỗ trợ quá trình tổng hợp Oligonucleotides nhằm đảm bảo độ chính xác và an toàn cho người thao tác thí nghiệm.
Xem thêm chi tiết về Tủ An Toàn Sinh Học Cấp II (BCS-W1000) tại đây.
Các thông số tủ An toàn Sinh học cấp II:
- Điện áp: 220V/50hz
- Tốc độ khí trung bình: ≥0.4m/s
- Tốc độ khí xuống: 0.25-0.5m/s
- Cường độ UV: ≥0.4µw/cm²
- Cường độ sáng: >430 Lux
- Vật liệu: INOX 304
- Điều khiển: Màn hình có nút nhấn
- Cửa trượt bằng kính cường lực dày 5mm
- Lọc HEPA: 99,99% đối với các hạt có kích thướt 0.3 micro
- Kích thước model: BSC-W1000
- Kích thước ngoài LxWxH:1000x740x1200
- Kích thước buồng thao tác:935x590x540
- Kích thước model: BSC-W1200
- Kích thước ngoài LxWxH:1200x800x1314
- Kích thước buồng thao tác:1133x646x538
Ưu điểm:
- Có hệ thống màng lọc HEPA lọc được 99,99% các hạt có kích thước 0,3 micro
- 70% khí cấp khí xuống khu vực làm việc, 30% ra ngoài môi trường
- Có cảm biến hành trình làm việc đảm bảo an toàn cho người sử dụng và bộ điều khiển bằng nút nhấn và màn hình
- Thiết kế module giúp lắp đặt dễ dàng, vật liệu inox cao cấp, chống chịu hóa chất và dễ dàng vệ sinh, thẩm mỹ cao
Tài liệu tham khảo
- Hao M, Qiao J, Qi H. Current and Emerging Methods for the Synthesis of Single-Stranded DNA. Genes (Basel). 2020 Jan 21;11(2):116. doi: 10.3390/genes11020116. PMID: 31973021; PMCID: PMC7073533. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31973021/
